Definicja statusu nisz komórek macierzystych ludzkiego płuca ex vivo w biopsjach tkanek wykonanych u pacjentów z rozedmą płuc i włóknieniem śródmiąższowym

Tło naukowe

Choroby zwyrodnieniowe płuc są wynikiem zdarzeń zapalnych, które kończą się zniszczeniem prawidłowej architektury płuc. Istnieją dwa główne wzorce:

1. Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności. Oczekuje się, że do 2020 roku stanie się trzecią przyczyną zgonów po chorobach układu krążenia i nowotworach. Rozedma płuc jest destrukcyjną postacią POChP polegającą na zanikaniu pęcherzyków płucnych. Ten anatomiczny wzór nie zawsze jest jednorodny, a upośledzenie czynnościowe nie jest związane ze stopniem zniszczenia tkanki. Terapeutyczną eliminację zniszczonej tkanki można osiągnąć chirurgicznie lub stosując różne techniki blokujące (Redukcja Objętości Płuc).
2. Zwłóknienie płuc (PF) charakteryzuje się nieprawidłową naprawą nabłonka oddechowego. Różne choroby mogą powodować PF, takie jak infekcje, choroby autoimmunologiczne (zaburzenia tkanki łącznej), sarkoidoza, zapalenie płuc z nadwrażliwości, pylica płuc, histiocytoza X, limfangioleiomiomatoza LAM itp. W wielu sytuacjach nie można ustalić związku przyczynowo-skutkowego, a choroba jest idiopatycznym IPF.

W ostatnich latach w różnych dziedzinach medycyny stały się dostępne terapie komórkowe z wykorzystaniem komórek progenitorowych i różnych rusztowań. Medycyna regeneracyjna płuc wydaje się być alternatywą dla transplantacji w tych schyłkowych chorobach.

Jednak bardzo złożony skład komórkowy płuc, obejmujący ponad 40 różnych typów komórek, sprawia, że ​​cel ten jest trudny. Nabłonkowa wyściółka dróg oddechowych, złożona z części przewodzącej i oddechowej, zmienia się wzdłuż osi bliższej i dalszej. Drogi oddechowe z tchawicy do oskrzelików ludzkich płuc składają się z nabłonka pseudostratyfikowanego, zawierającego w równych proporcjach komórki podstawne, komórki wydzielnicze i komórki rzęskowe, a także niektóre komórki neuroendokrynne. Najmniejsze oskrzeliki, znane jako oskrzeliki końcowe i oddechowe, są wyłożone prostym nabłonkiem walcowatym lub prostopadłościennym zawierającym komórki wydzielnicze i rzęskowe z mniejszą liczbą komórek podstawnych. Nabłonki tych przewodzących dróg oddechowych tworzą szczelną barierę przed światem zewnętrznym i są wyspecjalizowane w procesie oczyszczania śluzowo-rzęskowego. Pęcherzyki są wyścielone przez komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu 1 i 2, zwane dalej odpowiednio AT1 i AT2. Komórki te są również wyspecjalizowane w funkcji barierowej, a niezwykle cienkie AEC1 dzielą błonę podstawną z otaczającą siecią naczyń włosowatych płuc, aby ułatwić dyfuzję gazów między atmosferą a krążeniem.

Ten ogólny rozkład typów komórek nabłonkowych jest zachowany między ludźmi a organizmami modelowymi, takimi jak gryzonie. Istnieją jednak zauważalne różnice. Na przykład przejście z nabłonka pseudowarstwowego do walcowatego zachodzi u gryzoni bardziej proksymalnie, więc tylko tchawica i oskrzela pnia głównego są wyścielone nabłonkiem pseudowarstwowym. Prawie wszystkie wewnątrzpłatowe drogi oddechowe u myszy są wyścielone prostym nabłonkiem walcowatym lub prostopadłościennym z kilkoma komórkami podstawnymi. U myszy nagłe przejście z przewodzących dróg oddechowych do pęcherzyków płucnych jest znane jako połączenie przewodu oskrzelowo-pęcherzykowego. U ludzi oskrzeliki końcowe dają początek oskrzelikom oddechowym, z których wiele przewodów pęcherzykowych kończy się ostatecznie w pęcherzykach płucnych. Biorąc pod uwagę istotną rolę kompartmentu nabłonkowego w płucach, wiele wysiłku włożono w identyfikację nabłonkowych komórek macierzystych i progenitorowych odpowiedzialnych za funkcje regeneracyjne i naprawcze.

Progenitory nabłonka znajdują się w unikalnym mikrośrodowisku lub niszach, reprezentowanych przez komórki naczyniowe i mezenchymalne, które są bogato unerwione. Ta architektura bardzo przypomina nisze HSM.

U myszy poczyniono znaczne postępy w kierunku identyfikacji sygnałów regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych nabłonka płuc. Należą do nich Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb i cytokiny, w tym IL-4, -13 i -6. Sąsiadujące komórki nabłonkowe, komórki zrębowe (w tym komórki mezenchymalne, fibroblasty, komórki mięśni gładkich i śródbłonek) oraz komórki odpornościowe stanowią potencjalne źródła tych czynników. Wyraźne nisze komórek macierzystych zostały zdefiniowane w tchawicy i płucach dorosłych myszy w stanie stacjonarnym i istnieje coraz więcej dowodów na to, że w różnych stanach patologicznych nisze komórek macierzystych są dotknięte i zmienione.

Bardzo niewiele wiadomo o komórkach macierzystych i niszach komórek macierzystych w płucach dorosłego człowieka oraz o sygnałach regulujących utrzymanie homeostazy tkanki płucnej w zdrowiu i chorobie.

Niedawno grupa Reisnera z Instytutu Weizmanna wykazała, że ​​opróżnienie nisz komórek macierzystych płuc jest warunkiem wstępnym udanej transplantacji mysich lub ludzkich komórek progenitorowych płuc (Nature Medicine 2015). W tym celu wykorzystali wstępne uszkodzenie płuc naftalenem, które wywołało natychmiastową stymulację endogennych komórek progenitorowych. Zatem w ciągu 48 godzin dzielące się komórki progenitorowe mogły zostać skutecznie usunięte przez napromieniowanie całego ciała 6 Gy, umożliwiając skuteczne wszczepienie komórek progenitorowych płuc dawcy (ryc. 1).

Ryc. 1: Wszczepienie i funkcjonalna naprawa uszkodzonych płuc za pomocą embrionalnych komórek płucnych myszy. Po uszkodzeniu płuc NA i kondycjonowaniu 6Gy TBI, dorosłym myszom C57BL/6 przeszczepiono syngeniczne embrionalne komórki płuc w stadium E16 od dawców GFP+. ( a, b ) Reprezentatywne obrazy mikroskopii dwufotonowej o rozszerzonej ogniskowej płuc przeszczepionych myszy 6 tygodni po przeszczepie, pokazujące całą głębokość skanowania od góry do dołu chimerycznego płuca, bez (a: stos z 88 μm) i z ( b ) współbarwienie naczyń krwionośnych kropkami kwantowymi (kolor czerwony) (słupek=90μm). ( c ) Dwufotonowy obraz z rozszerzonym ogniskiem, pokazujący całą głębokość skanowania od góry do dołu chimerycznego płuca (z-stack 96 μm) 16 tygodni po przeszczepie. ( d ) Mikroskopia dwufotonowa nieprzeszczepionego płuca myszy C57BL pokazująca tło (słupek = 90 μm). (e, f, g) Reprezentatywne obrazy chimerycznych płuc barwionych anty-GFP (zielony) i anty-AQP-5 (czerwony), wskazujące na włączenie alweocytów typu I pochodzących od dawcy do powierzchni wymiany gazowej. (h, i, j) Chimeryczne płuco wybarwione przeciwciałami anty-GFP (zielone), anty-Sp-C (niebieskie), wykazujące pochodzące od dawcy surfaktanty wytwarzające alweocyty typu II (słupki = 20 μm). Wszystkie pojedyncze obrazy pokazane powyżej są reprezentatywne dla n=10 myszy zebranych z 3 niezależnych eksperymentów. (m, n) Pomiary funkcji płuc 6 tygodni po przeszczepie. ( k, l ) Barwienie chimerycznego płuca pod kątem CFTR (czerwony) i (GFP), wykazujące CFTR-dodatnie komórki dawcy. (m) Podstawowa podatność płuc. Porównanie nietkniętych myszy kontrolnych z myszami z uszkodzeniem płuc (test t-Studenta, P <0,001) i myszy z uszkodzeniem płuc w porównaniu z myszami z przeszczepem po urazie (test t-Studenta, P = 0,008). (n) Tłumienie tkanek. Porównanie myszy kontrolnych z myszami z uszkodzeniem płuc (test t-Studenta, P=0,015) i myszy z uszkodzeniem płuc w porównaniu z myszami, którym przeszczepiono płuca (test t-Studenta, P=0,021). Wartości są średnimi ± SEM 10-15 (n=15 kontrolnych, n=10 rannych i n=10 leczonych) myszy w każdej grupie zebranych z dwóch niezależnych eksperymentów. normalnych myszy, przewidujemy, że u pacjentów z różnymi chorobami płuc nisze płucne mogą być już częściowo wyczerpane, a zatem przeszczep może wymagać mniej surowego kondycjonowania.

Cel Scharakteryzowanie kompartmentów komórek macierzystych w ich niszach w różnych sytuacjach klinicznych (niechorobowych w porównaniu z tkanką płucną z rozedmą i zwłóknieniem) oraz ocena ich właściwości proliferacyjnych i rozwojowych in vitro.

Dalsze wdrażanie systemu hodowli organoidów płuc w badaniach przesiewowych leków i opracowywaniu spersonalizowanej medycyny pacjenta.

Metody Biopsje tkanki płucnej będą uzyskiwane metodami chirurgicznymi: otwartą biopsją płuca. Ta procedura jest rutynowo wykonywana w diagnostyce histologicznej chorób zwłóknieniowych. Pacjenci z rozedmą płuc i schyłkową chorobą zwłóknieniową są bardziej narażeni na rozwój raka płuc. U dużej części pacjentów leczonych chirurgicznie z rakiem płuca podłożem histologicznym jest rozedma płuc i choroba zwłóknieniowa. Lobektomia i pneumonektomia są często wykonywane jako najnowocześniejsze procedury w chirurgicznym leczeniu raka płuca. Część wyciętej tkanki płucnej zawiera zmiany rozedmowe i włókniste lub makroskopowo i mikroskopowo wygląda normalnie. Z tych „nienowotworowych” obszarów zostaną pobrane próbki i zachowane w Sheba Tissue Bank do oceny wraz z próbkami z obszarów zwłóknieniowych i rozedmowych. Biopsje zostaną poddane analizie immunohistologicznej, FACS i organoidom 3D (po usunięciu fibroblastów) w laboratorium immunologicznym Instytutu Weizmanna.

Wszystkie próbki będą pobierane po podpisaniu świadomej zgody pacjentów zarówno na wyznaczonym formularzu świadomej zgody dla tego protokołu, jak i na formularzu banku tkanek. Możemy mieć nawet 3-4 pacjentów tygodniowo. Pobrane próbki zostaną poddane resekcji przez doświadczony personel Oddziału Chirurgii Klatki Piersiowej lub Zakładu Patologii (w ramach zakresu obowiązków w Banku Tkanek). Świeże próbki zostaną przetransportowane do instytutu Weizmanna dla FACS i IHC.

Ponieważ wiedza na temat ludzkich tkanek płuc jest bardzo ograniczona, obowiązkowe będzie badanie tkanek płuc ze zdrowych i chorych płuc. Wstępnie sugerujemy przebadanie 10-15 zdrowych tkanek płuc i 15-20 chorych próbek w okresie 2 lat. Jak wspomniano wcześniej, normalne tkanki płuc zostaną uzyskane jako obszary „nienowotworowe” od pacjentów poddawanych lobektomii/pneumonektomii.