Definition af status for de humane lungestamcellenicher ex vivo i vævsbiopsier udført hos patienter med emfysem og interstitiel fibrose

Videnskabelig baggrund

Degenerative lungelidelser er resultatet af inflammatoriske hændelser, der ender i ødelæggelse af den normale lungearkitektur. Der findes to hovedmønstre:

1. Kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) er en væsentlig årsag til morbiditet og dødelighed. Indtil 2020 forventes det at blive den tredje dødsårsag efter hjerte-kar-sygdomme og kræft. Emfysem er den destruktive form for KOL, da det alveolerede væv forsvinder. Dette anatomiske mønster er ikke altid homogent, og funktionsnedsættelse er ikke forbundet med omfanget af vævsdestruktionen. Terapeutisk eliminering af det ødelagte væv kan opnås ved kirurgi eller ved at bruge forskellige blokeringsteknikker (lungevolumenreduktion).
2. Lungefibrose (PF) er karakteriseret ved unormal reparation af det respiratoriske epitel. Forskellige sygdomme kan resultere i PF såsom infektioner, autoimmune (bindevævsforstyrrelser), sarkoidose, overfølsomhedspneumonitis, pneumokoniose, histiocytose X, lymphangioleiomyomatosis LAM osv. I mange situationer kan en årsag og virkning ikke identificeres, og sygdommen er idiopatisk IPF.

I løbet af de sidste år er cellebaserede terapier ved brug af progenitorceller og forskellige stilladser blevet tilgængelige inden for forskellige medicinske områder. Lungeregenerativ medicin ser ud til at være et alternativ til transplantation i disse slutstadiesygdomme.

En meget kompleks cellulær sammensætning af lungen, der omfatter mere end 40 forskellige celletyper, gør imidlertid dette mål udfordrende. Epitelforingen af ​​luftvejene, der består af ledende og respiratoriske dele, varierer langs dens proximo-distale akse. De ledende luftveje fra luftrøret til bronkiolerne i menneskelige lunger består af pseudostratificeret epitel, der omfatter lige store andele af basalceller, sekretoriske celler og cilierede celler, såvel som nogle neuroendokrine celler. De mindste bronkioler, kendt som terminale og respiratoriske bronkioler, er foret med et simpelt søjleformet eller kubisk epitel indeholdende sekretoriske og cilierede celler med færre basalceller. Epitelet af disse ledende luftveje danner en tæt barriere mod omverdenen og er specialiseret til processen med mucociliær clearance. Alveolerne er foret med type 1 og 2 alveolære epitelceller, kaldet henholdsvis AT1 og AT2, herefter. Disse celler er også specialiserede til barrierefunktion, og de ekstremt tynde AEC1'er deler en basalmembran med det omgivende netværk af lungekapillærer for at lette diffusionen af ​​gasser mellem atmosfæren og cirkulationen.

Denne generelle fordeling af epitelcelletyper er bevaret mellem mennesker og modelorganismer såsom gnavere. Der er dog bemærkelsesværdige forskelle. For eksempel sker overgangen fra et pseudostratificeret til søjleformet epitel mere proksimalt hos gnavere, så kun luftrøret og hovedstammens bronkier er foret med et pseudostratificeret epitel. Næsten alle intralobare luftveje hos mus er foret med et simpelt søjleformet eller kubisk epitel med få basalceller. Hos mus er den bratte overgang fra en ledende luftvej til alveolerne kendt som en bronko-alveolær kanalforbindelse. Hos mennesker giver terminale bronkioler anledning til respiratoriske bronkioler, hvorfra mange alveolære kanaler afsluttes i alveolerne. I betragtning af den væsentlige rolle af epitelkammeret i lungen er der gjort en stor indsats for at identificere epitelstam- og progenitorceller, der er ansvarlige for regenerative og reparative funktioner.

Epiteliale stamceller opholder sig i unikke mikromiljøer eller nicher, repræsenteret af vaskulære og mesenkymale celler, som er rigt innerverede. Denne arkitektur minder meget om HSM-nicher.

Der er gjort betydelige fremskridt hos mus i retning af at identificere de signaler, der regulerer selvfornyelse og differentiering af lungeepitelstamceller. Disse omfatter Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb og cytokiner inklusive IL-4, -13 og -6. Tilstødende epitelceller, stromaceller (herunder mesenkymale celler, fibroblaster, glatte muskelceller og endotel) og immunceller repræsenterer alle potentielle kilder til disse faktorer. Distinkte stamcelle nicher er blevet defineret i voksne museluftrør og lunger i steady state, og der er stigende evidens for, at stamcelle nicher under forskellige patologiske tilstande påvirkes og ændres.

Meget lidt er kendt om stamceller og stamcelle-nicher i menneskelige voksne lunger og de signaler, der regulerer vedligeholdelsen af ​​lungevævets homeostase i sundhed og sygdom.

For nylig har Reisner-gruppen ved Weizmann Instituttet demonstreret, at forladelse af lungestamcelle-nicherne er en forudsætning for en vellykket transplantation af muse- eller humane lungeforfædre (Nature Medicine 2015). Til det formål brugte de en indledende lungeskade med naphthalen, som udløste en øjeblikkelig stimulering af endogene stamceller. Inden for 48 timer kunne de delende progenitorer således effektivt ableres ved 6 Gy total kropsbestråling, hvilket muliggjorde effektiv engraftment af donorlungeprogenitorer (fig. 1).

Fig. 1: Engraftment og funktionel reparation af beskadigede lunger af museembryonale lungeceller. Efter lungeskade med NA og konditionering med 6Gy TBI blev C57BL/6 voksne mus transplanteret med syngene E16-stadie embryonale lungeceller fra GFP+ donorer. (a,b) Repræsentative to-fotonmikroskopi udvidet fokusbilleder af lungerne af transplanterede mus 6 uger efter transplantation, der viser hele scanningsdybden fra top til bund af kimærisk lunge, uden (a: z-stack 88μm) og med (b) ) co-farvning af blodkar med Quantum dots (røde) (bar=90μm). (c) To-foton udvidet fokus billede, der viser hele scanningsdybden fra top til bund af kimærisk lunge (z-stack 96μm) 16 uger efter transplantation. (d) To-fotonmikroskopi af ikke-transplanteret C57BL muselunge, der viser baggrund (bar=90μm). (e,f,g) Repræsentative billeder af kimære lunger farvet med anti-GFP (grøn) og anti-AQP-5 (rød), hvilket indikerer inkorporering af donor-afledte type I-alveocytter i gasudvekslingsoverfladen. (h,i,j) Kimærisk lunge farvet med anti-GFP (grøn), anti-Sp-C antistoffer (blå), viser donorafledt overfladeaktivt stof, der producerer type II alveocytter (stænger=20μm). Alle de individuelle billeder vist ovenfor er repræsentative for n=10 mus samlet fra 3 uafhængige eksperimenter. (m,n) Lungefunktionsmålinger 6 uger efter transplantation. (k,l) Farvning af kimær lunge for CFTR (rød) og (GFP), der viser CFTR-positive donorceller. (m) Lungebaseline compliance. Sammenligning af intakte kontrolmus vs mus med lungeskade (Students t-test, P<0,001) og af mus med lungeskade vs mus transplanteret efter skade (Students t-test, P=0,008). (n) Vævsdæmpning. Sammenligning af kontrolmus vs mus med lungeskade (Students t-test, P=0,015) og af mus med lungeskade vs mus transplanteret efter skade (Students t-test, P=0,021). Værdierne er middelværdier ± SEM for 10-15 (n=15 kontrol, n=10 skadede og n=10 behandlede) mus i hver gruppe poolet fra to uafhængige eksperimenter. Selvom denne konditionering var påkrævet for at muliggøre effektiv engraftment af donorlunge-progenitorer i normale mus, forestiller vi os, at hos patienter med forskellige lungesygdomme kan lungenicherne allerede være delvist udtømte, og derfor kan transplantation kræve mindre alvorlig konditionering.

Formål At karakterisere stamcellekompartmenter i deres nicher i forskellige kliniske situationer (ikke-syge sammenlignet med emfysematøst og fibrotisk lungevæv) og at vurdere deres proliferative og udviklingsmæssige egenskaber in vitro.

For yderligere at implementere lungeorganoidkultursystem i lægemiddelscreening og udvikling af patienttilpasset medicin.

Metoder Biopsier af lungevæv vil blive opnået ved kirurgiske procedurer: åbne lungebiopsier. Denne procedure udføres rutinemæssigt til histologisk diagnose af fibrotiske sygdomme. Patienter med emfysem og fibrotisk sygdom i slutstadiet har højere risiko for at udvikle lungekræft. En stor del af kirurgisk behandlede lungekræftpatienter har emfysem og fibrotisk sygdom som histologisk baggrund. Lobektomi og pneumonektomi udføres ofte som state-of-the-art procedurer inden for kirurgisk behandling af lungekræft. En del af det resekerede lungevæv indeholder emfysematøse og fibrotiske forandringer eller får det til at se makroskopisk og mikroskopisk normalt ud. Disse "ikke-cancerøse" områder vil blive udtaget og bevaret i Sheba Tissue Bank til evaluering sammen med prøver fra fibrotiske og emfysematøse områder. Biopsierne vil blive analyseret med immunhistologi, FACS og 3D-organoider (efter fjernelse af fibroblaster) på immunologilaboratoriet på Weizmann Instituttet.

Alle prøver vil blive indsamlet efter informeret samtykke underskrifter fra patienter både på den udpegede informerede samtykkeformular for denne protokol og vævsbankformularen. Vi kan have så mange som 3-4 patienter/uge. Indsamlede prøver vil blive resekeret af erfarent personale enten fra Thoraxkirurgisk Afdeling eller Patologisk Afdeling (som en del af deres jobbeskrivelse i Vævsbanken). Friske prøver vil blive transporteret til Weizmann-instituttet for FACS og IHC.

Da der er meget begrænset viden om humant lungevæv, vil det være obligatorisk at teste lungevæv fra sunde og syge lunger. I første omgang foreslår vi at teste 10-15 normalt lungevæv og 15-20 syge prøver i løbet af en periode på 2 år. Som nævnt før vil det normale lungevæv blive opnået som "ikke-cancerøse" områder fra patienter, der gennemgår lobektomi/pneumonektomi.