Definição do Status dos Nichos de Células Tronco do Pulmão Humano ex Vivo em Biópsias de Tecidos Realizadas em Pacientes com Enfisema e Fibrose Intersticial

Formação Científica

As doenças pulmonares degenerativas são o resultado de eventos inflamatórios que terminam na destruição da arquitetura pulmonar normal. Existem dois padrões principais:

1. A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma das principais causas de morbidade e mortalidade. Até 2020, espera-se que se torne a terceira causa de mortalidade após doenças cardiovasculares e câncer. O enfisema é a forma destrutiva da DPOC à medida que o tecido alveolar desaparece. Esse padrão anatômico nem sempre é homogêneo e o comprometimento funcional não está relacionado à extensão da destruição tecidual. A eliminação terapêutica do tecido destruído pode ser conseguida por cirurgia ou pelo uso de várias técnicas de bloqueio (Redução do Volume Pulmonar).
2. A fibrose pulmonar (FP) é caracterizada pelo reparo anormal do epitélio respiratório. Várias doenças podem resultar em FP, como infecções, autoimunes (distúrbios do tecido conjuntivo), sarcoidose, pneumonite de hipersensibilidade, pneumoconiose, histiocitose X, linfangioleiomiomatose LAM etc. Em muitas situações, uma relação de causa e efeito não pode ser identificada e a doença é FPI idiopática.

Durante os últimos anos, as terapias baseadas em células usando células progenitoras e vários scaffolds tornaram-se disponíveis em vários campos médicos. A medicina regenerativa pulmonar parece ser uma alternativa ao transplante nessas doenças em estágio terminal.

No entanto, a composição celular muito complexa do pulmão, compreendendo mais de 40 tipos diferentes de células, torna esse objetivo desafiador. O revestimento epitelial do trato respiratório, composto de partes condutoras e respiratórias, varia ao longo de seu eixo próximo-distal. As vias aéreas condutoras da traquéia aos bronquíolos dos pulmões humanos consistem em epitélio pseudoestratificado, compreendendo proporções iguais de células basais, células secretoras e células ciliadas, bem como algumas células neuroendócrinas. Os bronquíolos menores, conhecidos como bronquíolos terminais e respiratórios, são revestidos por um epitélio simples colunar ou cúbico contendo células secretoras e ciliadas com menos células basais. Os epitélios dessas vias aéreas condutoras formam uma barreira firme contra o mundo externo e são especializados no processo de depuração mucociliar. Os alvéolos são revestidos por células epiteliais alveolares tipo 1 e 2, denominadas AT1 e AT2, respectivamente, a seguir. Essas células também são especializadas para a função de barreira e os AEC1s extremamente finos compartilham uma membrana basal com a rede circundante de capilares pulmonares para facilitar a difusão de gases entre a atmosfera e a circulação.

Essa distribuição geral de tipos de células epiteliais é conservada entre humanos e organismos modelo, como roedores. No entanto, existem diferenças notáveis. Por exemplo, a transição de um epitélio pseudoestratificado para colunar ocorre mais proximalmente em roedores, de modo que apenas a traqueia e os brônquios principais são revestidos por um epitélio pseudoestratificado. Quase todas as vias aéreas intralobares em camundongos são revestidas por um epitélio simples colunar ou cúbico com poucas células basais. Em camundongos, a transição abrupta de uma via aérea condutora para os alvéolos é conhecida como junção do ducto broncoalveolar. Nos seres humanos, os bronquíolos terminais dão origem aos bronquíolos respiratórios, dos quais muitos ductos alveolares terminam nos alvéolos. Considerando o papel essencial do compartimento epitelial no pulmão, muito esforço tem sido feito para identificar células-tronco epiteliais e células progenitoras responsáveis ​​pelas funções regenerativas e reparadoras.

Os progenitores epiteliais residem em microambientes ou nichos únicos, representados por células vasculares e mesenquimais, ricamente inervadas. Essa arquitetura se assemelha muito aos nichos HSM.

Um progresso considerável foi feito em camundongos para identificar os sinais que regulam a autorrenovação e a diferenciação das células-tronco epiteliais do pulmão. Estes incluem Notch, Hippo/Yap, ROS/Nrf2, EGF, FGF, c-myb e citocinas, incluindo IL-4, -13 e -6. Células epiteliais vizinhas, células estromais (incluindo células mesenquimais, fibroblastos, células musculares lisas e endotélio) e células imunes representam fontes potenciais para esses fatores. Nichos distintos de células-tronco foram definidos na traquéia e no pulmão de camundongos adultos no estado estacionário e há evidências crescentes de que em diferentes condições patológicas os nichos de células-tronco são afetados e alterados.

Muito pouco se sabe sobre células-tronco e nichos de células-tronco no pulmão humano adulto e os sinais que regulam a manutenção da homeostase do tecido pulmonar na saúde e na doença.

Recentemente, o grupo Reisner no Instituto Weizmann demonstrou que desocupar os nichos de células-tronco do pulmão é um pré-requisito para o transplante bem-sucedido de progenitores pulmonares de camundongos ou humanos (Nature Medicine 2015). Para isso, usaram uma lesão pulmonar inicial com naftaleno que desencadeou uma estimulação imediata de progenitores endógenos. Assim, dentro de 48 horas, os progenitores em divisão poderiam ser eficazmente eliminados por irradiação corporal total de 6 Gy, permitindo o enxerto eficaz de progenitores pulmonares doadores (Fig.1).

Fig. 1: Enxerto e reparo funcional de pulmões lesionados por células pulmonares embrionárias de camundongos. Após lesão pulmonar com NA e condicionamento com 6Gy TBI, camundongos adultos C57BL/6 foram transplantados com células pulmonares embrionárias de estágio E16 singênicas de doadores GFP+. (a, b) Imagens representativas de foco estendido de microscopia de dois fótons dos pulmões de camundongos transplantados 6 semanas após o transplante, mostrando toda a profundidade da varredura de cima para baixo do pulmão quimérico, sem (a: z-stack 88μm) e com (b ) co-coloração de vasos sanguíneos com pontos quânticos (vermelho) (barra = 90μm). (c) Imagem de foco estendido de dois fótons, mostrando toda a profundidade de varredura de cima para baixo do pulmão quimérico (z-stack 96μm) 16 semanas após o transplante. (d) Microscopia de dois fótons de pulmão de camundongo C57BL não transplantado mostrando fundo (barra = 90μm). (e,f,g) Imagens representativas de pulmões quiméricos corados com anti-GFP (verde) e anti-AQP-5 (vermelho), indicando incorporação de alveócitos tipo I derivados de doadores na superfície de troca gasosa. (h,i,j) Pulmão quimérico corado com anti-GFP (verde), anticorpos anti-Sp-C (azul), demonstrando surfactante derivado do doador produzindo alveócitos tipo II (barras = 20μm). Todas as imagens individuais mostradas acima são representativas de n = 10 camundongos agrupados de 3 experimentos independentes. (m,n) Medições da função pulmonar 6 semanas após o transplante. (k, l) Coloração do pulmão quimérico para CFTR (vermelho) e (GFP), demonstrando células doadoras positivas para CFTR. (m) Complacência da linha de base do pulmão. Comparação de camundongos intactos de controle versus camundongos com lesão pulmonar (teste t de Student, P<0,001) e de camundongos com lesão pulmonar versus camundongos transplantados após lesão (teste t de Student, P=0,008). (n) Amortecimento tecidual. Comparação de camundongos controle versus camundongos com lesão pulmonar (teste t de Student, P=0,015) e de camundongos com lesão pulmonar versus camundongos transplantados após lesão (teste t de Student, P=0,021). Os valores são médias ± SEM de 10-15 (n = 15 controles, n = 10 feridos e n = 10 tratados) camundongos em cada grupo agrupados de dois experimentos independentes. camundongos normais, imaginamos que em pacientes com diferentes doenças pulmonares, os nichos pulmonares já podem estar parcialmente esgotados e, portanto, o transplante pode exigir condicionamento menos severo.

Objectivo Caracterizar os compartimentos das células estaminais nos seus nichos em diferentes situações clínicas (não-doença em comparação com tecido pulmonar enfisematoso e fibrótico) e avaliar in vitro as suas propriedades proliferativas e de desenvolvimento.

Implementar ainda mais o sistema de cultura de organoides pulmonares na triagem de medicamentos e no desenvolvimento de medicamentos personalizados para pacientes.

Métodos As biópsias de tecido pulmonar serão obtidas por procedimentos cirúrgicos: biópsias pulmonares abertas. Este procedimento é realizado rotineiramente para diagnóstico histológico de doenças fibróticas. Pacientes com enfisema e doença fibrótica em estágio terminal têm maior risco de desenvolver câncer de pulmão. Uma grande proporção de pacientes com câncer de pulmão tratados cirurgicamente tem enfisema e doença fibrótica como antecedentes histológicos. A lobectomia e a pneumonectomia são freqüentemente realizadas como procedimentos de última geração no tratamento cirúrgico do câncer de pulmão. Parte do tecido pulmonar ressecado contém alterações enfisematosas e fibróticas ou parece macroscopicamente e microscopicamente normal. Essas áreas "não cancerígenas" serão coletadas e preservadas no Sheba Tissue Bank para avaliação junto com amostras de áreas fibróticas e enfisematosas. As biópsias serão analisadas por imuno-histologia, FACS e organoides 3D (após a retirada dos fibroblastos) no laboratório de imunologia do Instituto Weizmann.

Todas as amostras serão coletadas após as assinaturas de consentimento informado dos pacientes, tanto no formulário de consentimento informado designado para este protocolo quanto no formulário do banco de tecidos. Podemos ter até 3-4 pacientes/semana. As amostras coletadas serão ressecadas por pessoal experiente do Departamento de Cirurgia Torácica ou do Departamento de Patologia (como parte de sua descrição de trabalho no Banco de Tecidos). Amostras frescas serão transportadas para o Instituto Weizmann para FACS e IHC.

Como existe conhecimento muito limitado sobre tecidos pulmonares humanos, será obrigatório testar tecidos pulmonares de pulmões saudáveis ​​e doentes. Inicialmente sugerimos testar 10-15 tecidos pulmonares normais e 15-20 amostras doentes durante o período de 2 anos. Conforme mencionado anteriormente, os tecidos pulmonares normais serão obtidos como áreas "não cancerígenas" de pacientes submetidos a lobectomias/pneumectomias.