培地と胚盤胞の発生

まとめ：

ART 手順では、胚盤胞移植は最も生理学的な状況と見なすことができます。これは、胚が自然界で発生する段階と最も類似した段階で子宮腔に配置されるためです。 これらの潜在的な利点により、世界中で卵割段階から胚盤胞段階への胚移植に移行するセンターがますます増えています (Maheshwari et al., 2016)。 それにもかかわらず、いくつかの潜在的な欠点もあります。 このアプローチは、使用可能な胚 (移植または凍結保存に使用できるものとして定義) の総数を減少させます (Glujovsky et al., 2016)。 このアプローチの安全性に関するいくつかの懸念も提起されています。 特に、体外培養の延長された期間は、胚の発生に長期的な影響を与える可能性があります。 最近のメタアナリシスでは、胚盤胞期の移行は、早産 (<37 週)、超早産 (<32 週)、在胎週齢および周産期死亡率のリスクの増加と実際に関連していましたが、後者は以下からのみ特定されました。 1つの研究。 逆に、胚盤胞移植は、在胎週数が小さいことや双生児が消失するリスクの減少と関連していましたが、後者は 1 つの研究でしか報告されていません (Martins et al., 2017)。

文化メディアは、このコンテキストで重要な役割を果たします。 胚盤胞段階への胚の発生をサポートすることを目的とした 2 つの異なるアプローチが提案されています。「自然に戻る」順次アプローチと「胚に選択させる」単一媒体アプローチです (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012,クイン 2012)。

連続培養培地システムは、1 日目から 5 日目までの発生中の胚の特定された変化する代謝および栄養要件を満たすように設計されています (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999)。 このアプローチでは、胚は最初の培地で 3 日目まで成長し、卵割段階で 2 番目の培地に移されます。 目標は、卵管と子宮内のピルビン酸、乳酸、およびグルコースの濃度の観察された変化を反映するように設計された段階固有の培地に胚を曝露することです (Gardner et al., 1996)。

一方、単一培養培地は、発生中の胚が必要な栄養素を選択できるようにすると同時に、3 日目に培養環境の急激な変化にさらされることによるストレスを最小限に抑えることを目的としています。単一培地は培地交換で使用できます。 3日目に、または3日目に培地のリフレッシュがない単一ステップの中断のない培養で[Biggers et al。、2008]。 単一培養培地と連続培養培地の性能を比較した利用可能なデータは、両方のタイプの培地が発生中の胚に同様のサポートを提供しているように見えることを示唆しています (Sfontouris et al., 2017)。

研究とデザインの目的

この非介入研究の目的は、市販されている 2 つの異なるシングル ステップ培養培地 (GEMS およびアーバイン培養培地) で受精卵母細胞あたりの発芽率を比較することです。

採卵

連続採卵が行われます（42歳以下の女性からの卵母細胞を含み、4〜8個の正常に見えるMII卵母細胞を提示し、ローマの生殖医学センターで射精された精子でICSI治療を受けています）。 精巣形成率に対する潜在的な負の影響を排除するために、外科的に抽出された精子および非常に重度の乏精子奇形精子症 (準備後の運動精子数 < 500.000/ml) を持つカップルから来るすべての卵母細胞は除外されます。 単一遺伝子疾患または構造的染色体異常の PGD プログラムに登録されている患者からの卵母細胞も除外されます。

これは、センターの経験に基づいて見積もられており、この研究は18か月続きます。 インフォームド コンセントは、通常の使用における GENERA 標準形式です。 この研究は、クリニックの治験審査委員会によって承認されます。

卵母細胞の露出、評価および注入 すべての手順は、いかなる種類の介入もなしに、標準的な慣行に従って実行されます。

ピックアップ手順の直後に、卵母細胞は、40 IU/ml ヒアルロニダーゼ溶液への短時間の曝露によって卵丘から裸出され、続いて制御された温度環境で定義された直径のプラスチック ピペットを使用してコロナ ラジアータを機械的に除去します。 この手順は、hCG 投与後 37 時間から 40 時間の間に実行されます。 次に、中期 II (MII) 卵母細胞を未成熟卵母細胞から分離し、実体顕微鏡で評価します。 重度の形態学的異常を有するものは、品質が低いと見なされ (Rienzi et al., 2008 による)、比較から除外されます。 すべての MII 卵母細胞は、同じペトリ皿に配置されます。

無作為化表を使用して、各患者の卵母細胞を 2 つのグループにランダムに分割し、個別に受精させた後、GEMS (GERI 培地) とアーバイン (HSA を含む連続単一培養完了) の 2 つのシングル ステップ培養培地に保持します。 卵母細胞は、以前に記載された技術および器具（Rienzi et al., 1998）を使用してICSIを受ける。 個々の卵母細胞の発達の進行を追跡できるようにするために、各グループの受精卵母細胞を別々の皿で培養し、個々の卵母細胞を皿のマイクロウェル内の位置に従って識別します。 胚培養は 5 日目まで持続し、6%CO2 および 5%O2 を含む低酸素雰囲気のタイムラプス インキュベーター (GERI、Genea) で実行されます。

胚評価

GENERA の手順に従って、形態素解析を使用して、胚発生中のさまざまなイベント (シンガミー、卵割、圧縮、胞胚形成) の詳細な分析が評価されます。 さまざまなパラメーターが評価されます: ICSI 手順の終了とシンガミーの間の時間、2、3、4、5、および 8 セル (それぞれ T2、T3、T4、T5、T8) への切断の完了。第 1、第 2、第 3 の細胞周期 (それぞれ CC1、CC2、CC3) の長さ、および 3 から 4 および 5 から 8 の細胞 (それぞれ S2 と S3) の分裂における同期性。 標準的な胚盤胞の形態学的評価は、Gardner and Schoolcraft (1999) によって報告された基準に従って実行されます。 簡単に言えば、胚盤胞は、拡張の程度、内部細胞塊（ICM）および栄養外胚葉細胞（TE）の品質に従って評価されます。 ICM は細胞数と圧縮の程度によって評価され、TE は細胞の数、大きさ、および上皮の外観 (粘着性または緩み) によって評価されます。 胚盤胞形成に関連する形態動力学的パラメータも記録され、特に圧縮の開始、胞胚形成の開始、および胞胚形成の完了（それぞれTSC、TSB、TB）が記録されます。

統計的考察 主要な研究エンドポイントは、コホートの各半分で胚盤胞段階に発達する、いずれかの培地で培養された受精卵のパーセンテージとして計算された胚芽率です。 回収された卵母細胞が 4 ～ 8 個の女性のみが対象となるため、各女性の卵母細胞はランダムに 2 つのグループに分割され、受精率が 80% であると仮定すると、分析対象の研究集団は X*2 (X の場合) で構成されます。は登録された女性の数です) 2+ 卵母細胞のグループで、半分は 1 つの培地で培養され、もう 1 つは 2 番目の培地で培養されます。 得られたデータを分析するための最も明白なアプローチは、それを X (= 女性の数) 2x2 テーブルのセットと見なすことです。ここで、推定される量は、一方の媒質が他方に対して相対的に発芽するオッズ比です。女性を層別因子としてマンテル・ヘンツェル法で分析する（一次分析）。 全体の発芽率を 34% と仮定すると、7% の最小関連差は 1.4 の発芽率のオッズ比に相当します。 α=5% (両側) および検出力 = 80% でオッズ比 1.4 を検出するには、約 1200 (1182) 個の卵母細胞を含める必要があります (Hulley et al., 2013)。 、約 160 ～ 200 人の女性に相当します (約 6 卵子/女性を回収し、受精率を考慮して 80%)。

二次的な探索的分析では、ロジスティック モデルがデータに当てはめられ、従属バイナリ変数として芽球、層として女性が使用され、さまざまな予後因子の予測値と、それらのそれぞれと培地との間の可能な相互作用が評価されます。