배양 배지 및 배반포 발달

요약:

ART 절차에서 배반포 이식은 배아가 자연에서 발생하는 것과 가장 유사한 단계에서 자궁강에 배치되기 때문에 가장 생리적인 상황으로 간주될 수 있습니다. 이러한 잠재적 이점으로 인해 전 세계적으로 점점 더 많은 센터가 분열 단계에서 배반포 단계 배아 이식으로 이동했습니다(Maheshwari et al., 2016). 그럼에도 불구하고 몇 가지 잠재적인 단점도 있습니다. 이 접근법은 사용 가능한 배아(이송 또는 동결 보존에 사용 가능한 배아로 정의됨)의 총 수를 감소시킵니다(Glujovsky et al., 2016). 이 접근법의 안전성에 대한 몇 가지 우려도 제기되었습니다. 특히, 체외 배양 기간의 연장은 배아 발달에 장기적인 영향을 미칠 수 있습니다. 최근의 메타 분석에서 배반포 단계 전이는 실제로 조산(<37주), 초조산(<32주), 임신 주수 및 주산기 사망률의 위험 증가와 관련이 있었습니다. 한 연구. 반대로, 배반포 이식은 임신 주수에 대한 작은 위험과 소실된 쌍둥이의 위험 감소와 관련이 있었지만 후자는 한 연구에서만 보고되었습니다(Martins et al., 2017).

이러한 맥락에서 문화 매체는 중요한 역할을 합니다. 배반포 단계까지의 배아 발달을 지원하기 위한 두 가지 접근 방식이 제안되었습니다: "자연으로 돌아가는" 순차적 접근 방식과 "배아가 선택하게 하는" 단일 배지 접근 방식(Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, 퀸 2012).

순차 배양 배지 시스템은 1일부터 5일까지 발생하는 배아의 확인된 변화하는 대사 및 영양 요구 사항을 충족하도록 설계되었습니다(Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). 이 접근법을 통해 배아는 첫 번째 배지에서 3일까지 성장한 다음 분열 단계에서 두 번째 배지로 이동됩니다. 목표는 배아를 자궁에 비해 나팔관에서 관찰된 피루브산, 젖산염 및 포도당의 농도 변화를 반영하도록 설계된 단계별 배지에 노출시키는 것입니다(Gardner et al., 1996).

한편, 단일배양배지는 발달중인 배아가 필요로 하는 영양분을 선택하도록 함과 동시에 3일째 급격한 배양환경 변화에 대한 노출로 인한 스트레스를 최소화하는 것을 목표로 합니다. 3일째, 또는 3일째에 상쾌한 배지가 없는 단일 단계 연속 배양에서 [Biggers et al., 2008]. 단일 배양 배지와 순차 배양 배지의 성능을 비교하는 가용 데이터는 두 배지 유형 모두 발달 중인 배아에 유사한 지원을 제공하는 것으로 보입니다(Sfontouris et al., 2017).

연구 및 설계의 목표

이 비간섭적 연구의 목적은 상업적으로 이용 가능한 두 가지 단일 단계 배양 배지(GEMS 및 Irvine 배양 배지)에서 수정된 난모세포당 포파율을 비교하는 것입니다.

난자 채취

연속 난자 수집이 수행될 것입니다(42세 이하의 여성에서 나온 난모세포 포함, 4~8개의 정상으로 보이는 MII 난모세포를 제시하고 로마의 생식 의학 센터 GENERA에서 사정된 정자로 ICSI 치료를 받음). 포배율에 대한 잠재적인 부정적인 부계 영향을 배제하기 위해 수술로 적출된 정자와 매우 심각한 oligoastenoteratozoospermia(준비 후 운동성 정자 수 <500.000/ml)가 있는 부부의 모든 난모세포는 제외됩니다. 단일유전자 질환 또는 구조적 염색체 이상에 대한 PGD 프로그램에 등록된 환자의 난모세포도 제외됩니다.

센터 경험을 기반으로 추정되며 이 연구는 18개월 동안 지속될 것입니다. 정보에 입각한 동의는 일반적으로 사용되는 GENERA 표준 형식입니다. 이 연구는 클리닉의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받습니다.

난자 제거, 평가 및 주입 모든 절차는 어떤 종류의 개입 없이 표준 관행에 따라 수행됩니다.

픽업 절차 직후, 난모세포는 40 IU/ml 히알루로니다제 용액에 잠시 노출된 후 제어된 온도 환경에서 정의된 직경의 플라스틱 피펫을 사용하여 코로나 라디에타를 기계적으로 제거하여 난구 난구에서 벗겨집니다. 이 절차는 hCG 투여 후 37~40시간 사이에 수행됩니다. 중기 II(MII) 난모세포는 미성숙 난모세포에서 분리되고 입체현미경에서 평가됩니다. 심각한 형태적 이상이 있는 개체는 품질이 낮은 것으로 간주되어(Rienzi et al., 2008에 따름) 비교에서 제외됩니다. 모든 MII 난모세포는 동일한 페트리 접시에 배치됩니다.

무작위 테이블을 사용하여 각 환자의 난모세포를 무작위로 두 그룹으로 나누어 독립적으로 수정한 다음 2개의 단일 단계 배양 배지인 GEMS(GERI 배지) 및 Irvine(HSA를 사용한 연속 단일 배양)에 보관합니다. 난모세포는 이전에 기술된 기술 및 기구를 사용하여 ICSI를 받게 될 것이다(Rienzi et al., 1998). 개별 난모세포의 발달 진행을 추적할 수 있도록 각 그룹의 수정된 난모세포는 별도의 접시에서 배양되며 각 개별 난모세포는 접시 마이크로웰 내의 위치에 따라 식별됩니다. 배아 배양은 5일까지 지속되며 6% CO2 및 5%O2를 포함하는 저산소 분위기에서 타임랩스 인큐베이터(GERI, Genea)에서 수행됩니다.

배아 평가

GENERA 절차에 따라 배아 발달 중 다양한 사건(동합, 분열, 다짐 및 포배)에 대한 자세한 분석은 형태동력학 분석을 사용하여 평가됩니다. 다양한 매개변수가 평가될 것입니다: ICSI 절차의 끝과 syngamy 사이의 시간, 2, 3, 4, 5 및 8 세포(각각 T2, T3, T4, T5, T8)로의 절단 완료; 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 세포 주기의 길이(각각 CC1, CC2 및 CC3) 및 3개에서 4개로, 5개에서 8개 세포로의 분할(각각 S2 및 S3)에서의 동시성. 표준 배반포 형태 평가는 Gardner 및 Schoolcraft(1999)에 의해 보고된 기준에 따라 수행됩니다. 간단히 말해서, 배반포는 확장 정도, 내부 세포 덩어리(ICM) 및 영양외배엽 세포(TE)의 품질에 따라 평가됩니다. ICM은 세포의 수와 압축 정도에 따라 평가되는 반면 TE는 세포의 수, 치수 및 상피의 모양(응집성 또는 느슨한)에 따라 평가됩니다. 배반포 형성과 관련된 형태운동학적 매개변수, 특히 다짐 개시, 포파 개시 및 포파 완료(각각 TSC, TSB, TB)도 기록됩니다.

통계적 고려 사항 1차 연구 종료점은 코호트의 각 절반에서 배반포 단계로 발전하는 두 배지 중 하나에서 배양된 수정란의 백분율로 계산된 포파율입니다. 난모세포가 4~8개 사이인 여성만 대상이 되며 각 여성의 난모세포는 무작위로 2그룹으로 나뉘므로 수정률이 80%라고 가정하면 분석할 연구 모집단은 X*2로 구성됩니다(여기서 X 등록된 여성의 수) 2+ 난모세포의 그룹, 절반은 한 배지에서 배양되고 다른 하나는 두 번째 배지에서 배양됩니다. 결과 데이터 분석에 대한 가장 확실한 접근 방식은 X(=여성 수) 2x2 테이블 집합으로 간주하는 것입니다. 여기서 추정할 수 있는 양은 다른 매체에 대한 한 매체의 폭발의 오즈비입니다. 여성을 계층화 요인으로 하여 Mantel Haenszel 절차를 통해 분석합니다(1차 분석). 총 포파율이 34%라고 가정하면 최소 관련 차이 7%는 포파의 오즈비 1.4에 해당합니다. alfa=5%(2면) 및 검정력 = 80%로 승산비 1.4를 검출하려면 약 1200(1182)개의 난모세포가 포함되어야 합니다(Hulley et al., 2013). , 대략 160~200명의 여성에 해당합니다(약. 6개의 난모세포/여성이 회수되었고 수정률 80%를 고려함).

2차 탐색적 분석에서 다양한 예후 인자의 예측 값과 이들 각각과 배양 배지 사이의 가능한 상호 작용을 평가하기 위해 종속 이진 변수로 포배를 사용하고 계층으로 여성을 사용하여 데이터에 물류 모델을 맞출 것입니다.