Milieux de culture et développement de blastocystes

RÉSUMÉ:

Dans les procédures ART, le transfert de blastocyste peut être considéré comme la situation la plus physiologique, car l'embryon est placé dans la cavité utérine à un stade très similaire à celui qui se produit dans la nature. Ces avantages potentiels ont incité de plus en plus de centres à passer du stade de clivage au stade de transfert d'embryons au stade de blastocyste dans le monde entier (Maheshwari et al., 2016). Malgré cela, il existe également des inconvénients potentiels. Cette approche diminue le nombre total d'embryons utilisables (définis comme ceux disponibles pour le transfert ou la cryoconservation) (Glujovsky et al., 2016). Certaines préoccupations concernant la sécurité de cette approche ont également été soulevées. En particulier, la durée prolongée de la culture in vitro peut avoir un effet à long terme sur le développement de l'embryon. Dans une méta-analyse récente, le transfert du stade blastocyste était en effet associé à des risques accrus d'accouchement prématuré (<37 semaines), d'accouchement très prématuré (<32 semaines), important pour l'âge gestationnel et de mortalité périnatale, bien que cette dernière n'ait été identifiée qu'à partir de une étude. À l'inverse, le transfert de blastocyste était associé à une diminution du risque de jumeaux petits pour l'âge gestationnel et de disparition de jumeaux, bien que ce dernier n'ait été rapporté que par une seule étude (Martins et al., 2017).

Les médias culturels jouent un rôle crucial dans ce contexte. Deux approches distinctes visant à accompagner le développement de l'embryon jusqu'au stade blastocyste ont été proposées : l'approche séquentielle « retour à la nature » et l'approche « laisser l'embryon choisir » à milieu unique (Summers et al., 2003 ; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

Le système de milieu de culture séquentiel est conçu pour répondre aux besoins métaboliques et nutritionnels changeants identifiés de l'embryon en développement du jour 1 au jour 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Avec cette approche, les embryons sont cultivés jusqu'au jour 3 dans un premier milieu puis, au stade du clivage, sont déplacés vers un second. L'objectif est d'exposer les embryons à des milieux spécifiques au stade, conçus pour refléter les changements observés dans les concentrations de pyruvate, de lactate et de glucose dans la trompe de Fallope par rapport à l'utérus (Gardner et al., 1996).

D'autre part, les milieux de culture uniques visent à permettre aux embryons en développement de choisir les nutriments dont ils ont besoin, tout en minimisant le stress dû à l'exposition à un changement brusque de leur environnement de culture au jour 3. Les milieux uniques peuvent être utilisés avec un changement de milieu au jour 3, ou dans une culture ininterrompue en une seule étape, dans laquelle il n'y a pas de milieu de rafraîchissement au jour 3 [Biggers et al., 2008]. Les données disponibles comparant les performances des milieux de culture simples et séquentiels suggèrent que les deux types de milieux semblent fournir un soutien similaire à l'embryon en développement (Sfontouris et al., 2017).

Objectif de l'étude et de la conception

Le but de cette étude non interventionnelle est de comparer le taux de blastulation par ovocyte fécondé dans deux milieux de culture différents en une seule étape disponibles dans le commerce (milieux de culture GEMS et Irvine).

Collecte d'ovocytes

Une collecte consécutive d'ovules sera effectuée (avec inclusion d'ovocytes provenant d'une femme âgée de moins de 42 ans, présentant entre 4 et 8 ovocytes MII d'apparence normale et subissant un traitement ICSI avec du sperme éjaculé au Centre de médecine de la reproduction GENERA à Rome). Pour exclure un effet paternel négatif potentiel sur le taux de blastulation, tous les ovocytes provenant de couples avec des spermatozoïdes extraits chirurgicalement et une oligoasténotératozoospermie très sévère (nombre de spermatozoïdes mobiles <500 000/ml après préparation) seront exclus. Les ovocytes provenant de patientes inscrites au programme DPI pour des maladies monogéniques ou des anomalies chromosomiques structurelles seront également exclus.

On estime, sur la base de l'expérience du centre, que l'étude durera 18 mois. Le consentement éclairé est le format standard GENERA en usage courant. L'étude sera approuvée par le comité d'examen institutionnel de la clinique.

Dénudation, évaluation et injection des ovocytes Toutes les procédures seront réalisées selon la pratique courante sans aucune intervention.

Juste après la procédure de prélèvement, les ovocytes seront dénudés du cumulus oophorus par une brève exposition à une solution d'hyaluronidase à 40 UI/ml suivie d'une élimination mécanique de la corona radiata à l'aide de pipettes en plastique de diamètres définis dans un environnement à température contrôlée. Cette procédure sera effectuée entre 37 et 40 heures après l'administration d'hCG. Les ovocytes en métaphase II (MII) seront ensuite séparés des ovocytes immatures et évalués au stéréomicroscope. Ceux présentant des anomalies morphologiques sévères seront considérés comme de moindre qualité (selon Rienzi et al., 2008) et seront donc exclus de la comparaison. Tous les ovocytes MII seront placés dans la même boîte de Pétri.

À l'aide de tables de randomisation, les ovocytes de chaque patiente seront répartis au hasard en deux groupes qui seront inséminés indépendamment puis conservés dans 2 milieux de culture en une seule étape, GEMS (GERI Medium) et Irvine (Continuous Single Culture Complete with HSA). Les ovocytes seront soumis à l'ICSI en utilisant des techniques et des instrumentations décrites précédemment (Rienzi et al., 1998). Pour pouvoir suivre la progression du développement de l'ovocyte individuel, les ovocytes inséminés de chaque groupe seront cultivés dans des boîtes séparées et chaque ovocyte individuel sera identifié en fonction de sa position dans les micropuits de la boîte. La culture d'embryons durera jusqu'au jour 5 et sera réalisée dans un incubateur time-lapse (GERI, Genea) en atmosphère hypoxique contenant 6 % de CO2 et 5 % d'O2.

Évaluation de l'embryon

Conformément à la procédure GENERA, l'analyse détaillée de divers événements au cours du développement de l'embryon (syngamie, clivages, compactage et blastulation) sera évaluée à l'aide d'une analyse morphocinétique. Différents paramètres seront évalués : temps entre la fin de la procédure ICSI et la syngamie, achèvement du clivage en 2, 3, 4, 5 et 8 cellules (T2, T3, T4, T5, T8, respectivement) ; longueur du premier, deuxième et troisième cycle cellulaire (CC1, CC2 et CC3 respectivement) et synchronie dans la division de trois à quatre et cinq à huit cellules (S2 et S3, respectivement). L'évaluation morphologique standard du blastocyste sera effectuée selon les critères rapportés par Gardner et Schoolcraft (1999). En bref, les blastocystes seront évalués selon le degré d'expansion, la qualité de la masse cellulaire interne (ICM) et des cellules du trophectoderme (TE). L'ICM est évalué selon le nombre de cellules, et le degré de compaction, tandis que le TE est évalué selon le nombre, la dimension des cellules et l'aspect de l'épithélium (cohésif ou lâche). Les paramètres morphocinétiques liés à la formation du blastocyste seront également enregistrés et en particulier : initiation de la compaction, initiation de la blastulation et fin de la blastulation (TSC, TSB, TB, respectivement).

Considérations statistiques Le critère d'évaluation principal de l'étude est le taux de blastulation, calculé comme le pourcentage d'œufs fécondés, cultivés dans l'un ou l'autre milieu, qui se développent jusqu'au stade de blastocyste dans chaque moitié de la cohorte. Étant donné que seules les femmes avec entre 4 et 8 ovocytes récupérés seront éligibles, et que les ovocytes de chaque femme seront divisés au hasard en 2 groupes, en supposant un taux de fécondation de 80 %, la population d'étude à analyser sera composée de X*2 (où X est le nombre de femmes inscrites) groupes de 2+ ovocytes, la moitié cultivée dans un milieu et l'autre cultivée dans le second milieu. L'approche la plus évidente pour l'analyse des données obtenues est de les considérer comme un ensemble de tableaux X (= nombre de femmes) 2x2, où la quantité à estimer est l'odds ratio de blastulation d'un milieu par rapport à l'autre, pour être analysée au moyen de la procédure de Mantel Haenszel, avec la femme comme facteur de stratification (analyse primaire). En supposant un taux global de blastulation de 34 %, une différence pertinente minimale de 7 % correspond à un rapport de cotes de blastulation de 1,4. Afin de détecter avec alfa=5% (bilatéral) et puissance = 80% un rapport de cotes de 1,4, il faut inclure environ 1200 (1182) ovocytes (Hulley et al., 2013) répartis en 2 groupes de tailles égales , cela correspond approximativement à 160 - 200 femmes (aprox. 6 ovocytes/femme récupérés et considérant un taux de fécondation de 80%).

En analyse exploratoire secondaire, un modèle logistique sera ajusté aux données avec la blastulation comme variable binaire dépendante et la femme comme strate, pour évaluer la valeur prédictive de divers facteurs pronostiques et les interactions possibles entre chacun d'eux et le milieu de culture.