Meios de Cultura e Desenvolvimento de Blastocistos

RESUMO:

Nos procedimentos de TRA, a transferência do blastocisto pode ser considerada a situação mais fisiológica, pois o embrião é colocado na cavidade uterina em um estágio mais semelhante ao que ocorre na natureza. Esses benefícios potenciais induziram mais e mais centros a passar do estágio de clivagem para a transferência de embriões no estágio de blastocisto em todo o mundo (Maheshwari et al., 2016). Apesar disso, também existem algumas desvantagens potenciais. Essa abordagem diminui o número total de embriões utilizáveis ​​(definidos como aqueles disponíveis para transferência ou criopreservação) (Glujovsky et al., 2016). Algumas preocupações com relação à segurança dessa abordagem também foram levantadas. Em particular, a duração prolongada da cultura in vitro pode ter efeito de longo prazo no desenvolvimento do embrião. Em uma meta-análise recente, a transferência do estágio de blastocisto foi de fato associada a riscos aumentados de parto prematuro (<37 semanas), parto muito prematuro (<32 semanas), grande para a idade gestacional e mortalidade perinatal, embora esta última tenha sido identificada apenas em um estudo. Por outro lado, a transferência de blastocisto foi associada a uma diminuição do risco de gêmeos pequenos para a idade gestacional e desaparecimento, embora este último tenha sido relatado por apenas um estudo (Martins et al., 2017).

Os meios de cultura desempenham um papel crucial neste contexto. Duas abordagens distintas destinadas a apoiar o desenvolvimento do embrião até o estágio de blastocisto foram propostas: a abordagem sequencial "de volta à natureza" e a abordagem de meio único "deixe o embrião escolher" (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

O sistema de meio de cultura sequencial é projetado para atender às necessidades metabólicas e nutricionais identificadas do embrião em desenvolvimento do dia 1 ao dia 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Com esta abordagem, os embriões crescem até o dia 3 em um primeiro meio e depois, no estágio de clivagem, são movidos para um segundo meio. O objetivo é expor os embriões a meios específicos do estágio, projetados para refletir as alterações observadas nas concentrações de piruvato, lactato e glicose na trompa de Falópio versus o útero (Gardner et al., 1996).

Por outro lado, os meios de cultura únicos visam permitir que os embriões em desenvolvimento escolham os nutrientes de que necessitam, ao mesmo tempo em que minimizam o estresse da exposição a uma mudança abrupta em seu ambiente de cultura no dia 3. Os meios de cultura únicos podem ser usados ​​com uma mudança de meio no dia 3, ou em uma cultura ininterrupta de etapa única, na qual não há resfriamento do meio no dia 3 [Biggers et al., 2008]. Os dados disponíveis comparando o desempenho de meios de cultura únicos e sequenciais sugerem que ambos os tipos de meios parecem fornecer suporte semelhante ao embrião em desenvolvimento (Sfontouris et al., 2017).

Objetivo do estudo e projeto

O objetivo deste estudo não intervencional é comparar a taxa de blastulação por oócito fertilizado em dois diferentes meios de cultura de etapa única disponíveis comercialmente (meios de cultura GEMS e Irvine).

Coleta de ovócitos

A coleta consecutiva de óvulos será realizada (com inclusão de oócitos provenientes de mulheres com menos de 42 anos de idade, apresentando entre 4 e 8 oócitos MII de aparência normal e submetidas a tratamento ICSI com esperma ejaculado no Centro de Medicina Reprodutiva GENERA em Roma). Para excluir potencial efeito paterno negativo na taxa de blastulação, todos os oócitos provenientes de casais com espermatozóides extraídos cirurgicamente e oligoastenoteratozoospermia muito grave (contagem de espermatozóides móveis <500.000/ml após a preparação) serão excluídos. Oócitos provenientes de pacientes inscritos no programa PGD para doenças monogênicas ou anormalidades cromossômicas estruturais também serão excluídos.

Estima-se, com base na experiência do centro, que o estudo terá a duração de 18 meses. O consentimento informado é o formato padrão GENERA em uso comum. O estudo será aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Clínica.

Desnudação, avaliação e injeção de oócitos Todos os procedimentos serão realizados de acordo com a prática padrão, sem qualquer tipo de intervenção.

Logo após o procedimento de coleta, os oócitos serão desnudados do cumulus oophorus por uma breve exposição a 40 UI/ml de solução de hialuronidase seguida de remoção mecânica da corona radiata com o uso de pipetas plásticas de diâmetros definidos em um ambiente de temperatura controlada. Este procedimento será realizado entre 37 e 40 horas após a administração de hCG. Oócitos em metáfase II (MII) serão então separados dos oócitos imaturos e avaliados ao estereomicroscópio. Aqueles com anormalidades morfológicas graves serão considerados de qualidade inferior (segundo Rienzi et al., 2008) e, portanto, serão excluídos da comparação. Todos os oócitos MII serão colocados na mesma placa de Petri.

Usando tabelas de randomização, os oócitos de cada paciente serão divididos aleatoriamente em dois grupos que serão inseminados independentemente e posteriormente mantidos em 2 meios de cultura de etapa única, GEMS (GERI Medium) e Irvine (Continuous Single Culture Complete with HSA). Os oócitos serão submetidos à ICSI utilizando técnicas e instrumentações previamente descritas (Rienzi et al., 1998). Para poder acompanhar a progressão do desenvolvimento de oócitos individuais, os oócitos inseminados de cada grupo serão cultivados em placas separadas e cada oócito individual será identificado de acordo com sua posição dentro dos micropoços da placa. A cultura do embrião durará até o 5º dia e será realizada em incubadora time-lapse (GERI, Genea) em atmosfera hipóxica contendo 6%CO2 e 5%O2.

Avaliação do embrião

De acordo com o procedimento GENERA, a análise detalhada de vários eventos durante o desenvolvimento do embrião (singamia, clivagens, compactação e blastulação) será avaliada usando análise morfocinética. Vários parâmetros serão avaliados: tempo entre o final do procedimento de ICSI e singamia, conclusão da clivagem para 2, 3, 4, 5 e 8 células (T2, T3, T4, T5, T8, respectivamente); comprimento do primeiro, segundo e terceiro ciclo celular (CC1, CC2 e CC3, respectivamente) e sincronia na divisão de três para quatro e cinco para oito células (S2 e S3, respectivamente). A avaliação morfológica padrão do blastocisto será realizada de acordo com os critérios relatados por Gardner e Schoolcraft (1999). Resumidamente, os blastocistos serão avaliados quanto ao grau de expansão, qualidade da massa celular interna (ICM) e das células do trofectoderma (TE). O ICM é avaliado pelo número de células, e o grau de compactação, enquanto o TE é avaliado pelo número, dimensão das células e aspecto do epitélio (coeso ou solto). Parâmetros morfocinéticos relacionados à formação do blastocisto também serão registrados e, em particular: início da compactação, início da blastulação e finalização da blastulação (TSC, TSB, TB, respectivamente).

Considerações estatísticas O desfecho primário do estudo é a taxa de blastulação, calculada como a porcentagem de óvulos fertilizados, cultivados em qualquer um dos meios, que se desenvolvem até o estágio de blastocisto em cada metade da coorte. Uma vez que apenas mulheres com 4 a 8 oócitos recuperados serão elegíveis, e os oócitos de cada mulher serão divididos aleatoriamente em 2 grupos, assumindo uma taxa de fertilização de 80%, a população de estudo a ser analisada será composta por X*2 (onde X é o número de mulheres inscritas) grupos de 2+ oócitos, metade cultivada em um meio e a outra cultivada no segundo meio. A abordagem mais óbvia para a análise dos dados resultantes é considerá-los como um conjunto de X (= número de mulheres) tabelas 2x2, onde a quantidade a ser estimada é a razão de chances de blastulação de um meio em relação ao outro, para ser analisado por meio do procedimento de Mantel Haenszel, tendo a mulher como fator de estratificação (análise primária). Assumindo uma taxa geral de blastulação de 34%, uma diferença mínima relevante de 7% corresponde a uma razão de chances de blastulação de 1,4. Para detectar com alfa=5% (2 lados) e power = 80% uma razão de chance de 1,4, aproximadamente 1200 (1182) oócitos precisam ser incluídos (Hulley et al., 2013) divididos em 2 grupos de tamanhos iguais , que correspondem aproximadamente a 160 - 200 mulheres (aprox. 6 oócitos/mulher recuperados e considerando uma taxa de fertilização de 80%).

Em análise exploratória secundária, será ajustado aos dados um modelo logístico com blastulação como variável binária dependente e mulher como estrato, para avaliar o valor preditivo de vários fatores prognósticos e as possíveis interações entre cada um deles e o meio de cultura.