Kulturmedier og Blastocystudvikling

RESUMÉ:

Ved ART-procedurer kan blastocystoverførsel betragtes som den mest fysiologiske situation, da embryonet placeres i livmoderhulen på et stadie, der ligner det, der forekommer i naturen. Disse potentielle fordele har fået flere og flere centre til at flytte fra spaltningsstadiet til blastocyststadiets embryooverførsel over hele verden (Maheshwari et al., 2016). På trods af dette er der også nogle potentielle ulemper. Denne tilgang reducerer det samlede antal anvendelige embryoner (defineret som dem, der er tilgængelige til overførsel eller kryokonservering) (Glujovsky et al., 2016). Nogle bekymringer vedrørende sikkerheden ved denne tilgang er også blevet rejst. Især kan den forlængede varighed af in vitro-kulturen have langsigtet effekt på embryoudviklingen. I en nylig metaanalyse var blastocyststadieoverførsel faktisk forbundet med øget risiko for for tidlig fødsel (<37 uger), meget for tidlig fødsel (<32 uger), stor for svangerskabsalder og perinatal dødelighed, selvom sidstnævnte kun blev identificeret fra ét studie. Omvendt var blastocystoverførsel forbundet med et fald i risikoen for små for gestationsalder og forsvindende tvillinger, selvom sidstnævnte kun blev rapporteret af én undersøgelse (Martins et al., 2017).

Kulturmedier spiller en afgørende rolle i denne sammenhæng. To forskellige tilgange, der sigter mod at støtte embryoudvikling til blastocyststadiet, er blevet foreslået: den sekventielle "tilbage til naturen"-tilgangen og "lad embryoet vælge" enkelt medium tilgang (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

Sekventielt dyrkningsmediesystem er designet til at imødekomme identificerede skiftende metaboliske og ernæringsmæssige behov for det udviklende embryo fra dag 1 til dag 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Med denne fremgangsmåde dyrkes embryoner op til dag 3 i et første medium og flyttes derefter, på spaltningsstadiet, til et andet. Målet er at udsætte embryonerne for stadiespecifikke medier, designet til at afspejle observerede ændringer i koncentrationer af pyruvat, laktat og glukose i æggelederen versus livmoderen (Gardner et al., 1996).

På den anden side sigter enkeltdyrkningsmedier på at give udviklende embryoner mulighed for at vælge de næringsstoffer, de har brug for, og samtidig minimere stress fra eksponering for en brat ændring i deres dyrkningsmiljø på dag 3. Enkeltmedie kan bruges med en mediumændring på dag 3, eller i en enkelttrins uafbrudt kultur, hvor der ikke er nogen medium forfriskende på dag 3 [Biggers et al., 2008]. Tilgængelige data, der sammenligner ydeevnen af ​​enkelt- vs. sekventielle dyrkningsmedier, tyder på, at begge typer medier synes at give lignende støtte til det udviklende embryo (Sfontouris et al., 2017).

Formålet med undersøgelsen og design

Formålet med denne ikke-interventionelle undersøgelse er at sammenligne blastulationshastigheden pr. befrugtet oocyt i to forskellige enkelttrins dyrkningsmedier, der er kommercielt tilgængelige (GEMS og Irvine dyrkningsmedier).

Oocytopsamling

Konsekutiv ægudtagning vil blive udført (med inklusion af oocytter fra kvinde, der ikke er ældre end 42 år, med mellem 4 og 8 normale MII-oocytter og gennemgår ICSI-behandling med ejakuleret sæd i Center for Reproductive Medicine GENERA i Rom). For at udelukke potentiel negativ faderlig effekt på blastulationshastigheden vil alle oocytter, der kommer fra par med kirurgisk ekstraherede spermatozoer og meget alvorlig oligoastenoteratozoospermi (motil spermantal <500.000/ml efter præparation) blive udelukket. Oocytter, der kommer fra patienter, der er tilmeldt PGD-programmet for monogene sygdomme eller strukturelle kromosomale abnormiteter, vil også blive udelukket.

Det estimeres, baseret på centererfaring, at undersøgelsen vil vare i 18 måneder. Det informerede samtykke er GENERA standardformatet i almindelig brug. Undersøgelsen vil blive godkendt af Institutional Review Board of the Clinic.

Oocyttætning, evaluering og injektion Alle procedurer vil blive udført i overensstemmelse med standardpraksis uden nogen form for indgreb.

Lige efter opsamlingsproceduren vil oocytter blive fjernet fra cumulus oophorus ved en kort eksponering for 40 IE/ml hyaluronidaseopløsning efterfulgt af mekanisk fjernelse af corona radiata med brug af plastpipetter med definerede diametre i et kontrolleret temperaturmiljø. Denne procedure vil blive udført mellem 37 og 40 timer efter administration af hCG. Metafase II (MII) oocytter vil derefter blive adskilt fra de umodne oocytter og evalueret ved stereomikroskopet. Dem med alvorlige morfologiske abnormiteter vil blive betragtet som af lavere kvalitet (ifølge Rienzi et al., 2008) og vil således blive udelukket fra sammenligning. Alle MII oocytter vil blive placeret i den samme petriskål.

Ved hjælp af randomiseringstabeller vil oocytter fra hver patient blive tilfældigt opdelt i to grupper, der vil blive uafhængigt insemineret og efterfølgende opbevaret i 2 enkelttrins dyrkningsmedier, GEMS (GERI Medium) og Irvine (Continuous Single Culture Complete with HSA). Oocytter vil blive udsat for ICSI under anvendelse af tidligere beskrevne teknikker og instrumenter (Rienzi et al., 1998). For at kunne følge udviklingen af ​​individuelle oocytter, vil inseminerede oocytter fra hver gruppe blive dyrket i separate skåle, og hver enkelt oocyt vil blive identificeret i henhold til dens position i skålens mikrobrønde. Embryokultur vil vare op til dag 5 og vil blive udført i en time-lapse inkubator (GERI, Genea) i hypoxisk atmosfære indeholdende 6% CO2 og 5% O2.

Embryo vurdering

I henhold til GENERA-proceduren vil detaljeret analyse af forskellige hændelser under embryoudvikling (syngami, spaltninger, komprimering og blastulation) blive vurderet ved hjælp af morfokinetisk analyse. Forskellige parametre vil blive vurderet: tid mellem afslutningen af ​​ICSI-proceduren og syngami, afslutning af spaltning til 2, 3, 4, 5 og 8 celler (henholdsvis T2, T3, T4, T5, T8); længden af ​​den første, anden og tredje cellecyklus (henholdsvis CC1, CC2 og CC3) og synkronisering i delingen fra tre til fire og fem til otte celler (henholdsvis S2 og S3). Standard morfologisk vurdering af blastocyster vil blive udført i henhold til kriterierne rapporteret af Gardner og Schoolcraft (1999). Kort fortalt vil blastocysterne blive vurderet efter ekspansionsgraden, kvaliteten af ​​den indre cellemasse (ICM) og af trophectoderm-cellerne (TE). ICM vurderes i henhold til antallet af celler og graden af ​​komprimering, mens TE vurderes efter antallet, dimensionen af ​​cellerne og udseendet af epitelet (sammenhængende eller løst). Morfokinetiske parametre relateret til blastocystdannelse vil også blive registreret og i særdeleshed: initiering af komprimering, initiering af blastulation og afslutning af blastulation (henholdsvis TSC, TSB, TB).

Statistiske overvejelser Studiets primære endepunkt er blastulationshastigheden, beregnet som procentdelen af ​​befrugtede æg, dyrket i begge medier, der udvikler sig til blastocyststadiet i hver halvdel af kohorten. Da kun kvinder med mellem 4 og 8 hentede oocytter vil være berettigede, og oocytter fra hver kvinde vil blive opdelt tilfældigt i 2 grupper, forudsat en befrugtningsrate på 80 %, vil undersøgelsespopulationen, der skal analyseres, være sammensat af X*2 (hvor X er antallet af tilmeldte kvinder) grupper på 2+ oocytter, halvdelen dyrket i ét medium og den anden dyrket i det andet medium. Den mest oplagte tilgang til analysen af ​​de resulterende data er at betragte dem som et sæt af X (= antal kvinder) 2x2 tabeller, hvor mængden, der skal estimeres, er oddsforholdet for blastulation af et medium i forhold til det andet, til analyseres ved hjælp af Mantel Haenszel-proceduren, med kvinde som stratificeringsfaktor (primær analyse). Hvis man antager en samlet blastulationsrate på 34 %, svarer en minimal relevant forskel på 7 % til et oddsforhold for blastulation på 1,4. For at detektere med alfa=5% (2-sidet) og power = 80% et oddsforhold på 1,4, skal der inkluderes ca. 1200 (1182) oocytter (Hulley et al., 2013) opdelt i 2 grupper af lige store størrelser , hvilket svarer til cirka 160 - 200 kvinder (ca. 6 oocytter/kvinde hentet og overvejer en befrugtningsrate på 80 %).

I sekundær eksplorativ analyse vil en logistisk model blive tilpasset dataene med blastulation som den afhængige binære variabel og kvinde som stratum, for at vurdere den prædiktive værdi af forskellige prognostiske faktorer og de mulige interaktioner mellem hver af dem og dyrkningsmediet.