Terreni di coltura e sviluppo di blastocisti

RIEPILOGO:

Nelle procedure ART, il trasferimento di blastocisti può essere considerato la situazione più fisiologica, poiché l'embrione viene collocato nella cavità uterina in una fase molto simile a quella che si verifica in natura. Questi potenziali benefici hanno indotto sempre più centri a passare dalla fase di clivaggio a quella di blastocisti in tutto il mondo (Maheshwari et al., 2016). Nonostante questo, ci sono anche alcuni potenziali svantaggi. Questo approccio riduce il numero totale di embrioni utilizzabili (definiti come quelli disponibili per il trasferimento o la crioconservazione) (Glujovsky et al., 2016). Sono state sollevate anche alcune preoccupazioni riguardo alla sicurezza di questo approccio. In particolare, la durata prolungata della coltura in vitro può avere effetti a lungo termine sullo sviluppo dell'embrione. In una recente meta-analisi, il trasferimento in stadio di blastocisti è stato infatti associato ad un aumentato rischio di parto pretermine (<37 settimane), parto molto pretermine (<32 settimane), elevato per età gestazionale e mortalità perinatale, sebbene quest'ultima sia stata identificata solo da uno studio. Al contrario, il trasferimento di blastocisti è stato associato a una diminuzione del rischio di gemelli piccoli per l'età gestazionale e di scomparsa dei gemelli, sebbene quest'ultimo sia stato riportato da un solo studio (Martins et al., 2017).

I media culturali giocano un ruolo cruciale in questo contesto. Sono stati proposti due approcci distinti volti a sostenere lo sviluppo dell'embrione fino allo stadio di blastocisti: l'approccio sequenziale "ritorno alla natura" e l'approccio a mezzo singolo "lascia che sia l'embrione a scegliere" (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

Il sistema di terreni di coltura sequenziali è progettato per soddisfare le esigenze metaboliche e nutrizionali identificate in cambiamento dell'embrione in via di sviluppo dal giorno 1 al giorno 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Con questo approccio, gli embrioni vengono cresciuti fino al giorno 3 in un primo mezzo e poi, nella fase di scissione, vengono spostati in un secondo mezzo. L'obiettivo è quello di esporre gli embrioni a supporti specifici per stadio, progettati per riflettere i cambiamenti osservati nelle concentrazioni di piruvato, lattato e glucosio nella tuba di Falloppio rispetto all'utero (Gardner et al., 1996).

D'altra parte, i terreni di coltura singoli mirano a consentire agli embrioni in via di sviluppo di scegliere i nutrienti di cui hanno bisogno, minimizzando allo stesso tempo lo stress derivante dall'esposizione a un cambiamento improvviso nel loro ambiente di coltura il giorno 3. I terreni singoli possono essere utilizzati con un cambio di terreno il giorno 3, o in una coltura ininterrotta in un unico passaggio, in cui non vi è alcun mezzo di aggiornamento il giorno 3 [Biggers et al., 2008]. I dati disponibili che confrontano le prestazioni dei terreni di coltura singoli rispetto a quelli sequenziali suggeriscono che entrambi i tipi di terreno sembrano fornire un supporto simile allo sviluppo dell'embrione (Sfontouris et al., 2017).

Obiettivo dello studio e del progetto

Lo scopo di questo studio non interventistico è quello di confrontare il tasso di blastulazione per ovocita fecondato in due diversi mezzi di coltura a passaggio singolo disponibili in commercio (mezzi di coltura GEMS e Irvine).

Raccolta di ovociti

Verrà eseguito il prelievo consecutivo di ovociti (con inclusione di ovociti provenienti da donne di età non superiore a 42 anni, presentanti tra 4 e 8 ovociti MII di aspetto normale e sottoposti a trattamento ICSI con sperma eiaculato presso il Centro di Medicina della Riproduzione GENERA di Roma). Per escludere un potenziale effetto paterno negativo sulla velocità di blastulazione, saranno esclusi tutti gli ovociti provenienti da coppie con spermatozoi estratti chirurgicamente e oligoastenoteratozoospermia molto grave (conta di spermatozoi mobili <500.000/ml dopo la preparazione). Saranno esclusi anche gli ovociti provenienti da pazienti arruolate in PGD per malattie monogeniche o anomalie cromosomiche strutturali.

Si stima, in base all'esperienza del centro, che lo studio durerà 18 mesi. Il consenso informato è il formato standard GENERA di uso ordinario. Lo studio sarà approvato dall'Institutional Review Board della Clinica.

Denudazione, valutazione e iniezione degli ovociti Tutte le procedure saranno eseguite secondo la pratica standard senza alcun tipo di intervento.

Subito dopo la procedura di prelievo, gli ovociti saranno denudati dal cumulo ooforo mediante una breve esposizione a 40 IU/ml di soluzione di ialuronidasi seguita dalla rimozione meccanica della corona radiata con l'uso di pipette di plastica di diametro definito in un ambiente a temperatura controllata. Questa procedura verrà eseguita tra le 37 e le 40 ore dopo la somministrazione di hCG. Gli ovociti in metafase II (MII) saranno quindi separati dagli ovociti immaturi e valutati allo stereomicroscopio. Quelli con gravi anomalie morfologiche saranno considerati di qualità inferiore (secondo Rienzi et al., 2008) e saranno quindi esclusi dal confronto. Tutti gli ovociti MII saranno posti nella stessa Petri Dish.

Utilizzando le tabelle di randomizzazione, gli ovociti di ogni paziente saranno divisi casualmente in due gruppi che saranno inseminati indipendentemente e successivamente conservati in 2 terreni di coltura a passaggio singolo, GEMS (GERI Medium) e Irvine (Continuous Single Culture Complete with HSA). Gli ovociti saranno sottoposti a ICSI utilizzando tecniche e strumentazioni precedentemente descritte (Rienzi et al., 1998). Per essere in grado di seguire la progressione dello sviluppo dei singoli ovociti, gli ovociti inseminati di ciascun gruppo saranno coltivati ​​in piastre separate e ogni singolo ovocita sarà identificato in base alla sua posizione all'interno dei micropozzetti della piastra. La coltura dell'embrione durerà fino al giorno 5 e sarà eseguita in un incubatore time-lapse (GERI, Genea) in atmosfera ipossica contenente 6%CO2 e 5%O2.

Valutazione dell'embrione

Come da procedura GENERA, l'analisi dettagliata di vari eventi durante lo sviluppo dell'embrione (syngamy, clivaggi, compattazione e blastulazione) sarà valutata utilizzando l'analisi morfocinetica. Verranno valutati vari parametri: tempo tra la fine della procedura ICSI e la sinagoga, completamento del clivaggio a 2, 3, 4, 5 e 8 cellule (T2, T3, T4, T5, T8, rispettivamente); lunghezza del primo, secondo e terzo ciclo cellulare (CC1, CC2 e CC3 rispettivamente) e sincronia nella divisione da tre a quattro e da cinque a otto cellule (S2 e S3, rispettivamente). La valutazione morfologica standard della blastocisti sarà eseguita secondo i criteri riportati da Gardner e Schoolcraft (1999). In sintesi, le blastocisti saranno valutate in base al grado di espansione, alla qualità della massa cellulare interna (ICM) e delle cellule del trofectoderma (TE). L'ICM viene valutato in base al numero di cellule e al grado di compattazione, mentre il TE viene valutato in base al numero, alla dimensione delle cellule e all'aspetto dell'epitelio (coesivo o lasso). Saranno inoltre registrati i parametri morfocinetici relativi alla formazione della blastocisti ed in particolare: inizio della compattazione, inizio della blastulazione e completamento della blastulazione (TSC, TSB, TB, rispettivamente).

Considerazioni statistiche L'endpoint primario dello studio è il tasso di blastulazione, calcolato come percentuale di uova fecondate, coltivate in entrambi i terreni, che si sviluppano allo stadio di blastocisti in ciascuna metà della coorte. Poiché solo le donne con un numero di ovociti recuperati compreso tra 4 e 8 saranno ammissibili e gli ovociti di ciascuna donna saranno divisi casualmente in 2 gruppi, assumendo un tasso di fecondazione dell'80%, la popolazione dello studio da analizzare sarà composta da X*2 (dove X è il numero di donne arruolate) gruppi di 2+ ovociti, metà coltivati ​​in un terreno e l'altro coltivati ​​nel secondo terreno. L'approccio più ovvio all'analisi dei dati risultanti è considerarli come un insieme di tabelle X (= numero di donne) 2x2, dove la quantità da stimare è l'odds ratio di blastulazione di un mezzo rispetto all'altro, a essere analizzati mediante la procedura di Mantel Haenszel, con la donna come fattore di stratificazione (analisi primaria). Assumendo un tasso complessivo di blastulazione del 34%, una differenza minima rilevante del 7% corrisponde a un odds ratio di blastulazione di 1,4. Per rilevare con alfa=5% (2 lati) e potenza = 80% un odds ratio di 1,4, è necessario includere circa 1200 (1182) ovociti (Hulley et al., 2013) divisi in 2 gruppi di uguali dimensioni , che corrispondono a circa 160 - 200 donne (ca. 6 ovociti/donna prelevati e considerando un tasso di fecondazione dell'80%).

Nell'analisi esplorativa secondaria, un modello logistico sarà adattato ai dati con blastulazione come variabile binaria dipendente e donna come strato, per valutare il valore predittivo di vari fattori prognostici e le possibili interazioni tra ciascuno di essi e il terreno di coltura.