Kulttuurimedia ja blastokystien kehitys

YHTEENVETO:

ART-toimenpiteissä blastokystan siirtoa voidaan pitää fysiologisimpana tilanteena, koska alkio sijoitetaan kohdun onteloon siinä vaiheessa, joka muistuttaa eniten luonnossa esiintyvää. Nämä mahdolliset hyödyt ovat saaneet yhä useampia keskuksia siirtymään pilkkoutumisvaiheesta blastokystivaiheen alkionsiirtoon kaikkialla maailmassa (Maheshwari et al., 2016). Tästä huolimatta on myös joitain mahdollisia haittoja. Tämä lähestymistapa vähentää käyttökelpoisten alkioiden kokonaismäärää (määritelty siirtoon tai kylmäsäilytykseen käytettävissä oleviksi) (Glujovsky et al., 2016). Tämän lähestymistavan turvallisuudesta on myös esitetty joitakin huolenaiheita. Erityisesti in vitro -viljelmän pidennetyllä kestolla voi olla pitkäaikainen vaikutus alkion kehitykseen. Äskettäisessä meta-analyysissä blastokystavaiheen siirtyminen itse asiassa liittyi lisääntyneeseen ennenaikaisen synnytyksen (<37 viikkoa), erittäin ennenaikaisen synnytyksen (<32 viikkoa), suureen raskausikään ja perinataaliseen kuolleisuuteen, vaikka jälkimmäinen havaittiin vasta yksi tutkimus. Sitä vastoin blastokystan siirtyminen liittyi pienen raskausiän ja katoavien kaksosten riskiin, vaikka tämä jälkimmäinen raportoitiin vain yhdessä tutkimuksessa (Martins et al., 2017).

Kulttuurimedialla on tässä yhteydessä ratkaiseva rooli. Kaksi erillistä lähestymistapaa, joilla pyritään tukemaan alkion kehitystä blastokystavaiheeseen, on ehdotettu: "takaisin luontoon" -peräkkäinen lähestymistapa ja "antaa alkion valita" yhden väliaineen lähestymistapa (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

Peräkkäinen viljelyalustajärjestelmä on suunniteltu vastaamaan kehittyvän alkion tunnistettuja muuttuvia metabolisia ja ravitsemuksellisia tarpeita päivästä 1 päivään 5 (Gardner et ai. 1996, 1997, 1998, 1999). Tällä lähestymistavalla alkioita kasvatetaan päivään 3 saakka ensimmäisessä alustassa ja sitten, katkaisuvaiheessa, siirretään toiseen. Tavoitteena on altistaa alkiot vaihekohtaiselle alustalle, joka on suunniteltu heijastamaan havaittuja muutoksia munanjohtimien pyruvaatti-, laktaatti- ja glukoosipitoisuuksissa verrattuna kohtuun (Gardner et al., 1996).

Toisaalta yksittäisillä elatusaineilla pyritään antamaan kehittyville alkioille mahdollisuus valita tarvitsemansa ravintoaineet ja samalla minimoimaan stressiä, joka aiheutuu altistumisesta viljelyympäristön äkilliselle muutokselle päivänä 3. Yksittäistä alustaa voidaan käyttää alustan vaihdon yhteydessä. päivänä 3 tai yksivaiheisessa keskeytymättömässä viljelmässä, jossa ei ole elatusainetta virkistävä päivänä 3 [Biggers et al., 2008]. Saatavilla olevat tiedot, joissa verrataan yksittäisten vs. peräkkäisten viljelyalustojen suorituskykyä, viittaavat siihen, että molemmat alustat näyttävät tukevan samalla tavoin kehittyvää alkiota (Sfontouris et al., 2017).

Tutkimuksen tarkoitus ja suunnittelu

Tämän ei-interventiotutkimuksen tavoitteena on verrata blastulaationopeutta hedelmöitettyä munasolua kohti kahdessa eri kaupallisesti saatavilla olevassa yksivaiheisessa elatusaineessa (GEMS ja Irvine).

Oosyyttikokoelma

Suoritetaan peräkkäinen munasolukeräys (sisältää munasoluja, jotka tulevat alle 42-vuotiaalta naiselta, joilla on 4–8 normaalilta näyttävää MII-oosyyttiä ja jolle tehdään ICSI-hoito siemensyöksyllä siittiöistä Rooman lisääntymislääketieteen GENERA-keskuksessa). Mahdollisen negatiivisen isän vaikutuksen blastulaationopeuden poissulkemiseksi poissuljetaan kaikki munasolut, jotka ovat peräisin pariskunnilta, joilla on kirurgisesti uutettu siittiö ja erittäin vaikea oligoastenoteratozoospermia (liikkuva siittiöiden määrä <500 000/ml valmistuksen jälkeen). Oosyytit, jotka tulevat potilailta, jotka ovat osallistuneet PGD-ohjelmaan monogeenisten sairauksien tai rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien vuoksi, eivät myöskään sisälly.

On arvioitu, että tutkimuskeskuksen kokemuksen perusteella tutkimus kestää 18 kuukautta. Tietoinen suostumus on tavallisessa käytössä GENERA-standardimuoto. Tutkimuksen hyväksyy klinikan laitosarviointilautakunta.

Munasolujen denudaatio, arviointi ja injektio Kaikki toimenpiteet suoritetaan normaalin käytännön mukaisesti ilman minkäänlaista interventiota.

Heti poimintatoimenpiteen jälkeen oosyytit irrotetaan munakuumusta altistamalla lyhytaikaisesti 40 IU/ml hyaluronidaasiliuosta, mitä seuraa corona radiata mekaaninen poisto käyttämällä määritellyn halkaisijan omaavia muovipipettejä kontrolloidussa lämpötilassa. Tämä toimenpide suoritetaan 37–40 tuntia hCG:n annon jälkeen. Metafaasi II (MII) munasolut erotetaan sitten epäkypsistä munasoluista ja arvioidaan stereomikroskoopilla. Ne, joilla on vakavia morfologisia poikkeavuuksia, katsotaan laadultaan huonommiksi (Rienzi et al., 2008 mukaan) ja siten jätetään vertailun ulkopuolelle. Kaikki MII-oosyytti sijoitetaan samaan petrimaljaan.

Satunnaistustaulukoiden avulla kunkin potilaan munasolut jaetaan satunnaisesti kahteen ryhmään, jotka siemennetään itsenäisesti ja säilytetään sen jälkeen kahdessa yksivaiheisessa elatusaineessa, GEMS (GERI Medium) ja Irvine (jatkuva yksittäinen viljely, jossa on HSA). Oosyytit altistetaan ICSI:lle käyttämällä aiemmin kuvattuja tekniikoita ja instrumentteja (Rienzi et ai., 1998). Yksittäisen munasolun kehityksen etenemisen seuraamiseksi kunkin ryhmän inseminoidut munasolut viljellään erillisillä maljoilla ja jokainen yksittäinen munasolu tunnistetaan sen sijainnin mukaan maljan mikrokuopissa. Alkioiden viljely kestää päivään 5 ja se suoritetaan aikajaksoisessa inkubaattorissa (GERI, Genea) hypoksisessa ilmakehässä, joka sisältää 6 % CO2:ta ja 5 % O2:ta.

Alkion arviointi

GENERA-menettelyn mukaisesti erilaisten alkionkehityksen aikana tapahtuvien tapahtumien (syngamia, pilkkoutuminen, tiivistyminen ja räjähdys) yksityiskohtainen analyysi arvioidaan käyttämällä morfokineettistä analyysiä. Arvioidaan erilaisia ​​parametreja: aika ICSI-menettelyn päättymisen ja syngamian välillä, pilkkominen 2, 3, 4, 5 ja 8 soluksi (vastaavasti T2, T3, T4, T5, T8); ensimmäisen, toisen ja kolmannen solusyklin pituus (vastaavasti CC1, CC2 ja CC3) ja synkronointi jakautumisessa kolmesta neljään ja viidestä kahdeksaan soluun (S2 ja S3, vastaavasti). Normaali blastokystien morfologinen arviointi suoritetaan Gardnerin ja Schoolcraftin (1999) raportoimien kriteerien mukaisesti. Lyhyesti sanottuna blastokystit arvioidaan laajentumisasteen, sisäisen solumassan (ICM) ja trofektodermisolujen (TE) laadun mukaan. ICM arvioidaan solujen lukumäärän ja tiivistymisasteen mukaan, kun taas TE arvioidaan solujen lukumäärän, mittojen ja epiteelin ulkonäön mukaan (yhtenäinen tai löysä). Myös blastokystien muodostumiseen liittyvät morfokineettiset parametrit tallennetaan ja erityisesti: tiivistymisen aloitus, blastulaation alkaminen ja blastulaation päättyminen (vastaavasti TSC, TSB, TB).

Tilastolliset näkökohdat Tutkimuksen ensisijainen päätetapahtuma on blastulaationopeus, joka lasketaan hedelmöittyneiden munien prosenttiosuutena, joita viljellään kummassakin alustassa ja jotka kehittyvät blastokystivaiheeseen kussakin kohortin puoliskossa. Koska vain naiset, joilla on 4–8 otettua munasolua, ovat kelvollisia, ja jokaisen naisen munasolut jaetaan satunnaisesti kahteen ryhmään, olettaen 80 % hedelmöityssuhteen, analysoitava tutkimuspopulaatio koostuu X*2:sta (jossa X on ilmoittautuneiden naisten lukumäärä) ryhmät, joissa on 2+ oosyyttiä, puoliksi viljelty yhdessä alustassa ja toinen viljelty toisessa alustassa. Ilmeisin lähestymistapa tuloksena olevien tietojen analysointiin on pitää sitä X (= naisten lukumäärä) 2x2-taulukon joukona, jossa arvioitava määrä on yhden väliaineen räjähdyksen todennäköisyyssuhde toiseen. analysoidaan Mantel Haenszel -menettelyn avulla naisen kerrostumistekijänä (primäärianalyysi). Jos oletetaan, että räjäytysaste on 34 %, pienin relevantti ero 7 % vastaa räjäytyskertoimen suhdetta 1,4. Jotta havaittaisiin alfa = 5 % (2-puolinen) ja teho = 80 % todennäköisyyssuhteella 1,4, noin 1 200 (1 182) munasolua on sisällytettävä (Hulley et al., 2013) kahteen samankokoiseen ryhmään. , mikä vastaa noin 160 - 200 naista (noin. 6 munasolua/nainen otettu ja huomioon ottaen hedelmöitysaste 80 %).

Toissijaisessa tutkivassa analyysissä dataan sovitetaan logistinen malli, jossa blastulaatio on riippuvainen binäärimuuttuja ja nainen kerrostuksena, jotta voidaan arvioida erilaisten prognostisten tekijöiden ennustearvoa sekä niiden ja viljelyalustan välistä mahdollista vuorovaikutusta.