Media hodowlane i rozwój blastocysty

STRESZCZENIE:

W procedurach ART przeniesienie blastocysty można uznać za najbardziej fizjologiczną sytuację, ponieważ zarodek umieszczany jest w jamie macicy w stadium najbardziej zbliżonym do tego, jakie występuje w naturze. Te potencjalne korzyści skłoniły coraz więcej ośrodków do przenoszenia zarodków z stadium rozszczepienia do stadium blastocysty na całym świecie (Maheshwari i in., 2016). Mimo to istnieją również potencjalne wady. Takie podejście zmniejsza całkowitą liczbę możliwych do wykorzystania zarodków (zdefiniowanych jako dostępne do przeniesienia lub kriokonserwacji) (Glujovsky i in., 2016). Zgłoszono również pewne obawy dotyczące bezpieczeństwa tego podejścia. W szczególności przedłużony czas trwania hodowli in vitro może mieć długoterminowy wpływ na rozwój zarodka. W niedawnej metaanalizie przeniesienie stadium blastocysty było w rzeczywistości związane ze zwiększonym ryzykiem porodu przedwczesnego (<37 tygodni), bardzo przedwczesnym porodem (<32 tygodnie), dużą w stosunku do wieku ciążowego i śmiertelnością okołoporodową, chociaż ta ostatnia została zidentyfikowana tylko na podstawie jedno badanie. I odwrotnie, przeniesienie blastocysty wiązało się ze spadkiem ryzyka małych w stosunku do wieku ciążowego i zanikających bliźniąt, chociaż to ostatnie zostało zgłoszone tylko w jednym badaniu (Martins i in., 2017).

Media kultury odgrywają w tym kontekście kluczową rolę. Zaproponowano dwa różne podejścia mające na celu wspieranie rozwoju zarodka do stadium blastocysty: podejście sekwencyjne „powrót do natury” oraz podejście „pozwól zarodkowi wybrać” z wykorzystaniem jednego podłoża (Summers i in., 2003; Machtinger i in., 2012, Quinn 2012).

System pożywek sekwencyjnych jest zaprojektowany tak, aby spełniać zidentyfikowane zmieniające się wymagania metaboliczne i żywieniowe rozwijającego się zarodka od dnia 1 do dnia 5 (Gardner i wsp. 1996, 1997, 1998, 1999). Przy takim podejściu zarodki hoduje się do 3 dnia w pierwszej pożywce, a następnie na etapie bruzdkowania przenosi się do drugiej. Celem jest wystawienie zarodków na działanie pożywek specyficznych dla danego stadium rozwoju, zaprojektowanych tak, aby odzwierciedlały obserwowane zmiany stężenia pirogronianu, mleczanu i glukozy w jajowodzie w porównaniu z macicą (Gardner i in., 1996).

Z drugiej strony pojedyncze podłoża hodowlane mają na celu umożliwienie rozwijającym się zarodkom wyboru składników odżywczych, których potrzebują, przy jednoczesnej minimalizacji stresu związanego z nagłą zmianą środowiska hodowli w dniu 3. Pojedyncze podłoża mogą być używane ze zmianą podłoża w dniu 3 lub w jednoetapowej nieprzerwanej hodowli, w której nie ma odświeżania pożywki w dniu 3 [Biggers i in., 2008]. Dostępne dane porównujące wydajność pojedynczej i sekwencyjnej pożywki hodowlanej sugerują, że oba rodzaje pożywek wydają się zapewniać podobne wsparcie dla rozwijającego się zarodka (Sfontouris i in., 2017).

Cel badania i projektowania

Celem tego nieinterwencyjnego badania jest porównanie szybkości blastulacji na zapłodnioną komórkę jajową w dwóch różnych jednoetapowych pożywkach hodowlanych dostępnych w handlu (pożywki hodowlane GEMS i Irvine).

Kolekcja oocytów

Wykonane zostanie kolejne pobranie komórek jajowych (z włączeniem oocytów pochodzących od kobiety do 42 roku życia, posiadającej od 4 do 8 normalnie wyglądających oocytów MII i poddanej zabiegowi ICSI nasieniem z wytryskiem w Centrum Medycyny Rozrodu GENERA w Rzymie). W celu wykluczenia potencjalnego negatywnego wpływu ojca na szybkość blastulacji, wykluczone zostaną wszystkie oocyty pochodzące od par z plemnikami pobranymi chirurgicznie i bardzo ciężką oligoastenoteratozoospermią (liczba ruchliwych plemników <500 000/ml po przygotowaniu). Wykluczone zostaną również oocyty pochodzące od pacjentek włączonych do programu PGD z powodu chorób monogenowych lub strukturalnych nieprawidłowości chromosomalnych.

Szacuje się, na podstawie doświadczeń ośrodka, że ​​badanie potrwa 18 miesięcy. Świadoma zgoda to standardowy format GENERA w zwykłym użyciu. Badanie zostanie zatwierdzone przez Institutional Review Board of Clinic.

Obnażenie oocytów, ocena i iniekcja Wszystkie procedury będą wykonywane zgodnie ze standardową praktyką bez jakiejkolwiek interwencji.

Bezpośrednio po procedurze pobrania oocyty zostaną obnażone z wzgórka jajonośnego poprzez krótką ekspozycję na roztwór hialuronidazy o stężeniu 40 IU/ml, a następnie mechaniczne usunięcie korony promienistej za pomocą plastikowych pipet o określonej średnicy w kontrolowanym środowisku temperaturowym. Ta procedura zostanie przeprowadzona między 37 a 40 godziną po podaniu hCG. Oocyty metafazy II (MII) zostaną następnie oddzielone od niedojrzałych oocytów i ocenione pod mikroskopem stereoskopowym. Osoby z poważnymi nieprawidłowościami morfologicznymi zostaną uznane za osoby o niższej jakości (według Rienzi i in., 2008) i tym samym zostaną wykluczone z porównania. Wszystkie komórki jajowe MII zostaną umieszczone na tej samej szalce Petriego.

Korzystając z tabel randomizacji, oocyty od każdego pacjenta zostaną losowo podzielone na dwie grupy, które zostaną niezależnie zapłodnione, a następnie przechowywane w 2 jednoetapowych pożywkach hodowlanych, GEMS (pożywka GERI) i Irvine (ciągła pojedyncza hodowla pełna z HSA). Oocyty zostaną poddane ICSI przy użyciu wcześniej opisanych technik i oprzyrządowania (Rienzi i in., 1998). Aby móc śledzić postępy rozwojowe poszczególnych oocytów, zapłodnione oocyty z każdej grupy będą hodowane na oddzielnych szalkach, a każdy pojedynczy oocyt będzie identyfikowany zgodnie z jego położeniem w mikrodołkach szalki. Hodowla zarodków potrwa do 5 dnia i będzie prowadzona w inkubatorze poklatkowym (GERI, Genea) w atmosferze niedotlenionej zawierającej 6% CO2 i 5% O2.

Ocena zarodka

Zgodnie z procedurą GENERA szczegółowa analiza różnych zdarzeń podczas rozwoju zarodka (syngamia, bruzdowanie, zagęszczenie i blastulacja) zostanie oceniona za pomocą analizy morfokinetycznej. Oceniane będą różne parametry: czas między zakończeniem procedury ICSI a syngamią, zakończenie cięcia do 2, 3, 4, 5 i 8 komórek (odpowiednio T2, T3, T4, T5, T8); długość pierwszego, drugiego i trzeciego cyklu komórkowego (odpowiednio CC1, CC2 i CC3) oraz synchronizację w podziale od trzech do czterech i od pięciu do ośmiu komórek (odpowiednio S2 i S3). Standardowa ocena morfologiczna blastocysty zostanie przeprowadzona zgodnie z kryteriami podanymi przez Gardnera i Schoolcrafta (1999). W skrócie, blastocysty będą oceniane na podstawie stopnia ekspansji, jakości wewnętrznej masy komórkowej (ICM) i komórek trofektodermy (TE). ICM ocenia się na podstawie liczby komórek i stopnia zagęszczenia, podczas gdy TE ocenia się na podstawie liczby, wymiarów komórek i wyglądu nabłonka (spoisty lub luźny). Rejestrowane będą również parametry morfokinetyczne związane z powstawaniem blastocysty, aw szczególności: inicjacja zagęszczania, inicjacja blastulacji i zakończenie blastulacji (odpowiednio TSC, TSB, TB).

Rozważania statystyczne Pierwszorzędowym punktem końcowym badania jest częstość blastulacji, obliczona jako procent zapłodnionych komórek jajowych hodowanych na dowolnym podłożu, które rozwinęły się do stadium blastocysty w każdej połowie kohorty. Ponieważ kwalifikują się tylko kobiety z od 4 do 8 pobranymi oocytami, a oocyty od każdej kobiety zostaną losowo podzielone na 2 grupy, zakładając współczynnik zapłodnienia na poziomie 80%, badana populacja będzie się składać z X*2 (gdzie X to liczba zapisanych kobiet) grupy 2+ oocytów, połowa hodowana w jednym podłożu, a druga hodowana w drugim podłożu. Najbardziej oczywistym podejściem do analizy otrzymanych danych jest potraktowanie ich jako zestawu X (= liczba kobiet) tabel 2x2, gdzie wielkością do oszacowania jest iloraz szans wybuchu jednego ośrodka w stosunku do drugiego, do być analizowane za pomocą procedury Mantela Haenszela, z kobietą jako czynnikiem stratyfikacyjnym (analiza pierwotna). Zakładając ogólny wskaźnik blastulacji na poziomie 34%, minimalna istotna różnica wynosząca 7% odpowiada ilorazowi szans na wybuch na poziomie 1,4. Aby wykryć przy alfa=5% (2-stronne) i mocy = 80%, przy ilorazie szans 1,4, należy uwzględnić około 1200 (1182) oocytów (Hulley i in., 2013) podzielonych na 2 grupy o równej wielkości , co odpowiada około 160 - 200 kobietom (ok. Pobrano 6 oocytów/kobietę i biorąc pod uwagę wskaźnik zapłodnienia 80%).

We wtórnej analizie eksploracyjnej do danych zostanie dopasowany model logistyczny z blastulacją jako zależną zmienną binarną i kobietą jako warstwą, aby ocenić wartość predykcyjną różnych czynników prognostycznych i możliwe interakcje między każdym z nich a pożywką hodowlaną.