Kulturmedien und Blastozystenentwicklung

ZUSAMMENFASSUNG:

Bei ART-Verfahren kann der Blastozystentransfer als die physiologischste Situation angesehen werden, da der Embryo in der Gebärmutterhöhle in einem Stadium platziert wird, das dem in der Natur am ähnlichsten ist. Diese potenziellen Vorteile haben dazu geführt, dass immer mehr Zentren auf der ganzen Welt vom Teilungsstadium zum Embryotransfer im Blastozystenstadium übergehen (Maheshwari et al., 2016). Trotzdem gibt es auch einige potenzielle Nachteile. Dieser Ansatz verringert die Gesamtzahl verwendbarer Embryonen (definiert als diejenigen, die für den Transfer oder die Kryokonservierung verfügbar sind) (Glujovsky et al., 2016). Es wurden auch einige Bedenken hinsichtlich der Sicherheit dieses Ansatzes geäußert. Insbesondere die verlängerte Dauer der In-vitro-Kultur kann sich langfristig auf die Embryonalentwicklung auswirken. In einer kürzlich durchgeführten Metaanalyse war der Transfer des Blastozystenstadiums tatsächlich mit einem erhöhten Risiko einer Frühgeburt (< 37 Wochen), einer sehr frühen Geburt (< 32 Wochen), eines großen Gestationsalters und einer perinatalen Mortalität verbunden, obwohl letztere nur identifiziert wurde von eine Studie. Umgekehrt war der Blastozystentransfer mit einer Verringerung des Risikos für kleine Zwillinge im Gestationsalter und verschwindende Zwillinge verbunden, obwohl letzteres nur von einer Studie berichtet wurde (Martins et al., 2017).

Kulturmedien spielen dabei eine entscheidende Rolle. Es wurden zwei unterschiedliche Ansätze vorgeschlagen, die darauf abzielen, die Entwicklung des Embryos bis zum Blastozystenstadium zu unterstützen: der sequentielle „Zurück-zur-Natur“-Ansatz und der Einzelmedium-Ansatz „den Embryo wählen lassen“ (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quin 2012).

Das sequentielle Kulturmediensystem ist so konzipiert, dass es die identifizierten sich ändernden Stoffwechsel- und Ernährungsanforderungen des sich entwickelnden Embryos von Tag 1 bis Tag 5 erfüllt (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Bei diesem Ansatz werden Embryonen bis zum 3. Tag in einem ersten Medium gezüchtet und dann im Teilungsstadium in ein zweites Medium überführt. Ziel ist es, die Embryonen stadienspezifischen Medien auszusetzen, die die beobachteten Änderungen der Konzentrationen von Pyruvat, Laktat und Glukose im Eileiter gegenüber dem Uterus widerspiegeln (Gardner et al., 1996).

Andererseits zielen Einzelkulturmedien darauf ab, es den sich entwickelnden Embryonen zu ermöglichen, die Nährstoffe auszuwählen, die sie benötigen, und gleichzeitig den Stress durch eine abrupte Änderung ihrer Kulturumgebung am Tag 3 zu minimieren. Einzelmedien können mit einem Mediumwechsel verwendet werden an Tag 3, oder in einer einstufigen ununterbrochenen Kultur, in der es an Tag 3 keine Mediumauffrischung gibt [Biggers et al., 2008]. Verfügbare Daten, die die Leistung einzelner vs. sequenzieller Kulturmedien vergleichen, legen nahe, dass beide Medientypen den sich entwickelnden Embryo ähnlich zu unterstützen scheinen (Sfontouris et al., 2017).

Ziel der Studie und Gestaltung

Das Ziel dieser nicht-interventionellen Studie ist es, die Blastulationsrate pro befruchteter Oozyte in zwei verschiedenen im Handel erhältlichen einstufigen Kulturmedien (GEMS- und Irvine-Kulturmedien) zu vergleichen.

Oozyten-Sammlung

Es wird eine konsekutive Eizellentnahme durchgeführt (mit Einschluss von Oozyten, die von einer Frau stammen, die nicht älter als 42 Jahre ist, zwischen 4 und 8 normal aussehende MII-Oozyten aufweist und sich einer ICSI-Behandlung mit ejakuliertem Sperma im Zentrum für Reproduktionsmedizin GENERA in Rom unterzieht). Um einen möglichen negativen Einfluss des Vaters auf die Blastulationsrate auszuschließen, werden alle Eizellen von Paaren mit chirurgisch entnommenen Spermien und sehr schwerer Oligoastenoteratozoospermie (Anzahl der beweglichen Spermien <500.000/ml nach der Präparation) ausgeschlossen. Eizellen, die von Patientinnen stammen, die an einem PID-Programm für monogene Erkrankungen oder strukturelle Chromosomenanomalien teilnehmen, werden ebenfalls ausgeschlossen.

Es wird geschätzt, basierend auf der Erfahrung des Zentrums, dass die Studie 18 Monate dauern wird. Die informierte Einwilligung ist das GENERA-Standardformat im gewöhnlichen Gebrauch. Die Studie wird vom Institutional Review Board der Klinik genehmigt.

Oozyten-Denudation, -Evaluierung und -Injektion Alle Verfahren werden gemäß der Standardpraxis ohne jeglichen Eingriff durchgeführt.

Unmittelbar nach dem Entnahmeverfahren werden die Eizellen vom Cumulus oophorus durch kurzes Einwirken von 40 IE/ml Hyaluronidase-Lösung, gefolgt von der mechanischen Entfernung der Korona radiata unter Verwendung von Kunststoffpipetten mit definierten Durchmessern in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur, denudiert. Dieses Verfahren wird zwischen 37 und 40 Stunden nach der hCG-Verabreichung durchgeführt. Metaphase II (MII)-Oozyten werden dann von den unreifen Oozyten getrennt und am Stereomikroskop ausgewertet. Diejenigen mit schweren morphologischen Auffälligkeiten werden als minderwertig eingestuft (nach Rienzi et al., 2008) und werden daher vom Vergleich ausgeschlossen. Alle MII-Eizellen werden in dieselbe Petrischale gegeben.

Unter Verwendung von Randomisierungstabellen werden Eizellen von jeder Patientin nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen aufgeteilt, die unabhängig voneinander besamt und anschließend in 2 Einschritt-Kulturmedien gehalten werden, GEMS (GERI-Medium) und Irvine (kontinuierliche Einzelkultur komplett mit HSA). Eizellen werden einer ICSI unterzogen, wobei zuvor beschriebene Techniken und Instrumente verwendet werden (Rienzi et al., 1998). Um den Entwicklungsfortschritt einzelner Eizellen verfolgen zu können, werden befruchtete Eizellen aus jeder Gruppe in separaten Schalen kultiviert und jede einzelne Eizelle wird anhand ihrer Position in den Mikrovertiefungen der Schale identifiziert. Die Embryokultur dauert bis zum 5. Tag und wird in einem Zeitraffer-Inkubator (GERI, Genea) in einer hypoxischen Atmosphäre mit 6 % CO2 und 5 % O2 durchgeführt.

Embryobeurteilung

Gemäß dem GENERA-Verfahren wird eine detaillierte Analyse verschiedener Ereignisse während der Embryonalentwicklung (Syngamie, Spaltungen, Verdichtung und Blastulation) mithilfe einer morphokinetischen Analyse bewertet. Verschiedene Parameter werden bewertet: Zeit zwischen dem Ende des ICSI-Verfahrens und Syngamie, Abschluss der Teilung auf 2, 3, 4, 5 und 8 Zellen (jeweils T2, T3, T4, T5, T8); Länge des ersten, zweiten und dritten Zellzyklus (CC1, CC2 bzw. CC3) und Synchronität in der Teilung von drei auf vier und fünf auf acht Zellen (jeweils S2 und S3). Die standardmäßige morphologische Beurteilung der Blastozyste wird gemäß den von Gardner und Schoolcraft (1999) berichteten Kriterien durchgeführt. Kurz gesagt werden die Blastozysten nach Expansionsgrad, Qualität der inneren Zellmasse (ICM) und der Trophektodermzellen (TE) bewertet. Die ICM wird nach der Anzahl der Zellen und dem Verdichtungsgrad bewertet, während die TE nach der Anzahl, der Größe der Zellen und dem Aussehen des Epithels (zusammenhängend oder locker) bewertet wird. Morphokinetische Parameter im Zusammenhang mit der Blastozystenbildung werden ebenfalls aufgezeichnet, insbesondere: Beginn der Verdichtung, Beginn der Blastulation und Abschluss der Blastulation (jeweils TSC, TSB, TB).

Statistische Erwägungen Der primäre Studienendpunkt ist die Blastulationsrate, berechnet als Prozentsatz befruchteter Eizellen, die in beiden Medien kultiviert werden und sich in jeder Hälfte der Kohorte zum Blastozystenstadium entwickeln. Da nur Frauen mit zwischen 4 und 8 entnommenen Eizellen in Frage kommen und die Eizellen jeder Frau nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen aufgeteilt werden, setzt sich die zu analysierende Studienpopulation unter der Annahme einer Befruchtungsrate von 80 % aus X*2 zusammen (wobei X ist die Anzahl der eingeschriebenen Frauen) Gruppen von 2+ Oozyten, die Hälfte in einem Medium kultiviert und die andere in dem zweiten Medium kultiviert. Der naheliegendste Ansatz zur Analyse der resultierenden Daten besteht darin, sie als einen Satz von X (= Anzahl der Frauen) 2x2-Tabellen zu betrachten, wobei die zu schätzende Menge das Wahrscheinlichkeitsverhältnis der Blastulation eines Mediums relativ zum anderen ist mit dem Mantel-Haenszel-Verfahren mit Frau als Stratifizierungsfaktor (Primäranalyse) analysiert werden. Geht man von einer Gesamtblastulationsrate von 34 % aus, entspricht eine minimale relevante Differenz von 7 % einer Odds Ratio der Blastulation von 1,4. Um mit alfa=5% (2-seitig) und Power = 80% ein Odds Ratio von 1,4 zu erkennen, müssen ca. 1200 (1182) Oozyten eingeschlossen werden (Hulley et al., 2013), aufgeteilt in 2 gleich große Gruppen , das entspricht etwa 160 - 200 Frauen (ca. 6 Eizellen/Frau entnommen und unter Berücksichtigung einer Befruchtungsrate von 80 %).

In der sekundären explorativen Analyse wird ein logistisches Modell mit Blastulation als abhängiger binärer Variable und Frau als Stratum an die Daten angepasst, um den Vorhersagewert verschiedener prognostischer Faktoren und die möglichen Wechselwirkungen zwischen jedem von ihnen und dem Kulturmedium zu bewerten.