Питательные среды и развитие бластоцист

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ:

В процедурах ВРТ перенос бластоцисты можно считать наиболее физиологичной ситуацией, так как эмбрион помещается в полость матки на стадии, наиболее похожей на ту, что происходит в природе. Эти потенциальные преимущества побудили все больше и больше центров по всему миру перейти от стадии дробления к стадии переноса эмбрионов на стадии бластоцисты (Maheshwari et al., 2016). Несмотря на это, есть и некоторые потенциальные недостатки. Этот подход уменьшает общее количество пригодных к использованию эмбрионов (определяемых как доступные для переноса или криоконсервации) (Glujovsky et al., 2016). Также были высказаны некоторые опасения относительно безопасности этого подхода. В частности, увеличенная продолжительность культивирования in vitro может оказывать долгосрочное влияние на развитие эмбриона. В недавнем метаанализе перенос стадии бластоцисты был фактически связан с повышенным риском преждевременных родов (<37 недель), очень преждевременных родов (<32 недель), большой для гестационного возраста и перинатальной смертности, хотя последняя была выявлена ​​только в одно исследование. Наоборот, перенос бластоцисты ассоциировался со снижением риска рождения маленьких для гестационного возраста и исчезающих близнецов, хотя о последнем сообщалось только в одном исследовании (Martins et al., 2017).

Культурные СМИ играют решающую роль в этом контексте. Были предложены два различных подхода, направленных на поддержку развития эмбриона до стадии бластоцисты: последовательный подход «возврат к природе» и подход «предоставление эмбриону выбора» с одной средой (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Куинн 2012).

Система последовательных питательных сред предназначена для удовлетворения выявленных изменений метаболических и пищевых потребностей развивающегося эмбриона с 1 по 5 день (Gardner et al., 1996, 1997, 1998, 1999). При таком подходе эмбрионы выращивают до 3-х суток на первой среде, а затем, на стадии дробления, перемещают на вторую. Цель состоит в том, чтобы подвергнуть эмбрионы воздействию среды, специфичной для стадии, предназначенной для отражения наблюдаемых изменений концентраций пирувата, лактата и глюкозы в фаллопиевой трубе по сравнению с маткой (Gardner et al., 1996).

С другой стороны, однокомпонентные питательные среды предназначены для того, чтобы позволить развивающимся эмбрионам выбирать необходимые им питательные вещества, в то же время сводя к минимуму стресс от воздействия резкого изменения среды их культивирования на 3-й день. Одиночные среды можно использовать со сменой среды. на 3-й день, либо в одностадийной непрерывной культуре, при которой на 3-й день нет обновления среды [Biggers et al., 2008]. Имеющиеся данные, сравнивающие эффективность одиночных и последовательных культуральных сред, позволяют предположить, что оба типа сред, по-видимому, обеспечивают одинаковую поддержку развивающемуся эмбриону (Sfontouris et al., 2017).

Цель исследования и дизайн

Цель этого неинтервенционного исследования состоит в том, чтобы сравнить скорость бластуляции на оплодотворенный ооцит в двух различных одноступенчатых культуральных средах, имеющихся в продаже (питательные среды GEMS и Irvine).

Коллекция ооцитов

Будет проведен последовательный сбор яйцеклеток (с включением ооцитов, полученных от женщины не старше 42 лет, имеющей от 4 до 8 нормальных ооцитов MII и прошедшей лечение ИКСИ с эякулированной спермой в Центре репродуктивной медицины GENERA в Риме). Чтобы исключить потенциальное негативное влияние отца на частоту бластулирования, все ооциты, полученные от пар с хирургически извлеченными сперматозоидами и очень тяжелой олигоастенотератозооспермией (количество подвижных сперматозоидов <500 000/мл после подготовки), будут исключены. Также будут исключены ооциты, полученные от пациенток, включенных в программу ПГД по поводу моногенных заболеваний или структурных хромосомных аномалий.

По оценкам, исходя из опыта центра, исследование продлится 18 месяцев. Информированное согласие является стандартным форматом GENERA для обычного использования. Исследование будет одобрено Институциональным наблюдательным советом клиники.

Обнажение ооцитов, оценка и инъекция Все процедуры будут выполняться в соответствии со стандартной практикой без какого-либо вмешательства.

Сразу после процедуры забора ооциты отделяют от кумулюса придатка путем кратковременного воздействия раствора гиалуронидазы 40 МЕ/мл с последующим механическим удалением лучистого венца с использованием пластиковых пипеток определенного диаметра в условиях контролируемой температуры. Эта процедура будет выполняться между 37 и 40 часами после введения ХГЧ. Затем ооциты метафазы II (MII) отделяют от незрелых ооцитов и оценивают на стереомикроскопе. Те, у кого серьезные морфологические аномалии, будут считаться более низкого качества (согласно Rienzi et al., 2008) и, таким образом, будут исключены из сравнения. Все ооциты MII будут помещены в одну и ту же чашку Петри.

Используя таблицы рандомизации, ооциты от каждой пациентки будут случайным образом разделены на две группы, которые будут независимо осеменены и впоследствии помещены в 2 одностадийные питательные среды: GEMS (среда GERI) и Irvine (непрерывная однократная культура, полная с HSA). Ооциты будут подвергнуты ИКСИ с использованием ранее описанных методов и инструментов (Rienzi et al., 1998). Чтобы иметь возможность отслеживать развитие отдельных ооцитов, осемененные ооциты из каждой группы будут культивироваться в отдельных чашках, и каждый отдельный ооцит будет идентифицирован в соответствии с его положением в микролунках чашек. Культивирование эмбрионов продлится до 5-го дня и будет проводиться в инкубаторе с интервальной съемкой (GERI, Genea) в гипоксической атмосфере, содержащей 6% CO2 и 5% O2.

Оценка эмбриона

В соответствии с процедурой GENERA будет проведен подробный анализ различных событий во время развития эмбриона (сингамия, дробление, уплотнение и бластуляция) с использованием морфокинетического анализа. Будут оцениваться различные параметры: время между окончанием процедуры ИКСИ и сингамией, завершение расщепления до 2, 3, 4, 5 и 8 клеток (Т2, Т3, Т4, Т5, Т8 соответственно); длина первого, второго и третьего клеточного цикла (СС1, СС2 и СС3 соответственно) и синхронность в делении от трех до четырех и от пяти до восьми клеток (S2 и S3 соответственно). Стандартная морфологическая оценка бластоцисты будет проводиться в соответствии с критериями, изложенными Гарднером и Скулкрафтом (1999). Вкратце, бластоцисты будут оцениваться по степени расширения, качеству внутренней клеточной массы (ICM) и клеток трофэктодермы (TE). ICM оценивают по количеству клеток и степени уплотнения, тогда как TE оценивают по количеству, размеру клеток и внешнему виду эпителия (сплоченный или рыхлый). Также будут зарегистрированы морфокинетические параметры, связанные с образованием бластоцисты, в частности: начало уплотнения, начало бластуляции и завершение бластуляции (TSC, TSB, TB соответственно).

Статистические соображения Первичной конечной точкой исследования является частота бластуляции, рассчитанная как процент оплодотворенных яйцеклеток, культивируемых в любой среде, которые развиваются до стадии бластоцисты в каждой половине когорты. Поскольку только женщины с от 4 до 8 извлеченных ооцитов будут иметь право на участие, а ооциты от каждой женщины будут случайным образом разделены на 2 группы, предполагая уровень оплодотворения 80%, исследуемая популяция для анализа будет состоять из X * 2 (где X представляет собой количество зарегистрированных женщин) групп из 2+ ооцитов, половина которых культивируется в одной среде, а другая — во второй среде. Наиболее очевидный подход к анализу полученных данных состоит в том, чтобы рассматривать их как набор X (= количество женщин) таблиц 2x2, где оцениваемое количество представляет собой отношение шансов бластулирования одной среды по отношению к другой, к быть проанализированы с помощью процедуры Мантеля-Хензеля с женщиной в качестве фактора стратификации (первичный анализ). Предполагая, что общая частота бластулирования составляет 34%, минимальная релевантная разница в 7% соответствует отношению шансов бластуляции 1,4. Для обнаружения с альфа = 5% (2-сторонний) и мощностью = 80%, отношение шансов 1,4, необходимо включить примерно 1200 (1182) ооцитов (Hulley et al., 2013), разделенных на 2 группы одинакового размера , что соответствует примерно 160-200 женщинам (ок. Получено 6 ооцитов/женщину, учитывая коэффициент оплодотворения 80%).

Во вторичном исследовательском анализе к данным с бластуляцией в качестве зависимой бинарной переменной и женщиной в качестве страты будет подогнана логистическая модель для оценки прогностической ценности различных прогностических факторов и возможных взаимодействий между каждым из них и культуральной средой.