Kulturmedier og Blastocystutvikling

SAMMENDRAG:

I ART-prosedyrer kan blastocystoverføring betraktes som den mest fysiologiske situasjonen, da embryoet er plassert i livmorhulen på et stadium som ligner mest på det som forekommer i naturen. Disse potensielle fordelene har fått flere og flere sentre til å gå fra spaltningsstadiet til blastocyststadiet embryooverføring over hele verden (Maheshwari et al., 2016). Til tross for dette er det også noen potensielle ulemper. Denne tilnærmingen reduserer det totale antallet brukbare embryoer (definert som de som er tilgjengelige for overføring eller kryokonservering) (Glujovsky et al., 2016). Noen bekymringer angående sikkerheten til denne tilnærmingen har også blitt reist. Spesielt kan den utvidede varigheten av in vitro-kulturen ha langsiktig effekt på embryoutviklingen. I en fersk metaanalyse var overføring av blastocyststadium faktisk assosiert med økt risiko for prematur fødsel (<37 uker), svært prematur fødsel (<32 uker), stor for svangerskapsalder og perinatal dødelighet, selv om sistnevnte kun ble identifisert fra en studie. Omvendt var blastocystoverføring assosiert med en reduksjon i risikoen for små for svangerskapsalder og forsvinnende tvillinger, selv om sistnevnte ble rapportert av bare én studie (Martins et al., 2017).

Kulturmedier spiller en avgjørende rolle i denne sammenhengen. To distinkte tilnærminger som tar sikte på å støtte embryoutvikling til blastocyststadiet har blitt foreslått: "tilbake til naturen" sekvensiell tilnærming og "la embryoet velge" enkelt medium tilnærming (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

Sekvensielt kulturmediesystem er designet for å møte identifiserte endrede metabolske og ernæringsmessige krav til det utviklende embryoet fra dag 1 til dag 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Med denne tilnærmingen dyrkes embryoer opp til dag 3 i et første medium, og deretter, på spaltningsstadiet, flyttes de til et andre. Målet er å eksponere embryoene for stadiumspesifikke medier, designet for å reflektere observerte endringer i konsentrasjoner av pyruvat, laktat og glukose i egglederen kontra livmoren (Gardner et al., 1996).

På den annen side tar enkeltkulturmedier sikte på å la utviklende embryoer velge næringsstoffene de trenger, samtidig som de minimerer stress fra eksponering for en brå endring i kulturmiljøet på dag 3. Enkeltmedier kan brukes med en medium endring på dag 3, eller i en ett-trinns uavbrutt kultur, der det ikke er noen medium forfriskning på dag 3 [Biggers et al., 2008]. Tilgjengelige data som sammenligner ytelsen til enkelt- vs. sekvensielle kulturmedier tyder på at begge typer medier ser ut til å gi lignende støtte til det utviklende embryoet (Sfontouris et al., 2017).

Mål med studiet og design

Målet med denne ikke-intervensjonelle studien er å sammenligne blastulasjonshastigheten per befruktet oocytt i to forskjellige enkelttrinns dyrkingsmedier som er kommersielt tilgjengelige (GEMS og Irvine kulturmedier).

Oocyttsamling

Konsekutiv egginnsamling vil bli utført (med inkludering av oocytter som kommer fra kvinne som ikke er eldre enn 42 år, med mellom 4 og 8 normale MII-oocytter og som gjennomgår ICSI-behandling med ejakulert sæd i Center for Reproductive Medicine GENERA i Roma). For å utelukke potensiell negativ paternal effekt på blastulasjonshastigheten, vil alle oocytter som kommer fra par med kirurgisk ekstraherte spermatozoer og svært alvorlig oligoastenoteratozoospermi (motile spermier <500 000/ml etter tilberedning) bli ekskludert. Oocytter som kommer fra pasienter som er registrert i PGD-programmet for monogene sykdommer eller strukturelle kromosomavvik vil også bli ekskludert.

Det er estimert, basert sentererfaring, studiet vil vare i 18 måneder. Det informerte samtykket er GENERA standardformat i vanlig bruk. Studien vil bli godkjent av Institutional Review Board of the Clinic.

Oocyttavstøting, evaluering og injeksjon Alle prosedyrene vil bli utført i henhold til standard praksis uten noen form for intervensjon.

Like etter oppsamlingsprosedyren vil oocytter bli fjernet fra cumulus oophorus ved en kort eksponering for 40 IE/ml hyaluronidaseoppløsning etterfulgt av mekanisk fjerning av corona radiata ved bruk av plastpipetter med definerte diametre i et kontrollert temperaturmiljø. Denne prosedyren vil bli utført mellom 37 og 40 timer etter administrering av hCG. Metafase II (MII) oocytter vil deretter bli separert fra de umodne oocyttene og evaluert ved stereomikroskopet. De med alvorlige morfologiske abnormiteter vil bli vurdert av lavere kvalitet (ifølge Rienzi et al., 2008) og vil dermed bli ekskludert fra sammenligning. All MII oocytten vil bli plassert i samme petriskål.

Ved å bruke randomiseringstabeller vil oocytter fra hver pasient deles tilfeldig i to grupper som vil bli uavhengig inseminert og deretter holdes i 2 enkelttrinns kulturmedier, GEMS (GERI Medium) og Irvine (Continuous Single Culture Complete with HSA). Oocytter vil bli utsatt for ICSI ved bruk av tidligere beskrevne teknikker og instrumenter (Rienzi et al., 1998). For å kunne følge utviklingen av individuell oocytt, vil inseminerte oocytter fra hver gruppe bli dyrket i separate skåler og hver enkelt oocytt vil bli identifisert i henhold til sin posisjon i skålens mikrobrønner. Embryokultur vil vare opp til dag 5 og vil bli utført i en time-lapse inkubator (GERI, Genea) i hypoksisk atmosfære som inneholder 6 % CO2 og 5 % O2.

Embryovurdering

I henhold til GENERA-prosedyren vil detaljert analyse av ulike hendelser under embryoutvikling (syngami, spaltninger, komprimering og blastulering) bli vurdert ved bruk av morfokinetisk analyse. Ulike parametere vil bli vurdert: tid mellom slutten av ICSI-prosedyren og syngami, fullføring av spaltning til 2, 3, 4, 5 og 8 celler (henholdsvis T2, T3, T4, T5, T8); lengden på den første, andre og tredje cellesyklusen (henholdsvis CC1, CC2 og CC3) og synkronisering i delingen fra tre til fire og fem til åtte celler (henholdsvis S2 og S3). Standard morfologisk vurdering av blastocyster vil bli utført i henhold til kriteriene rapportert av Gardner og Schoolcraft (1999). Kort fortalt vil blastocystene bli evaluert i henhold til ekspansjonsgraden, kvaliteten på den indre cellemassen (ICM) og til trophectoderm-cellene (TE). ICM vurderes i henhold til antall celler, og graden av komprimering, mens TE vurderes i henhold til antall, dimensjon på cellene og utseendet til epitelet (sammenhengende eller løst). Morfokinetiske parametere knyttet til blastocystdannelse vil også bli registrert og spesielt: initiering av komprimering, initiering av blastulering og fullføring av blastulering (henholdsvis TSC, TSB, TB).

Statistiske betraktninger Det primære endepunktet for studien er blastulasjonshastigheten, beregnet som prosentandelen av befruktede egg, dyrket i begge medium, som utvikler seg til blastocyststadiet i hver halvdel av kohorten. Siden bare kvinner med mellom 4 og 8 hentede oocytter vil være kvalifisert, og oocytter fra hver kvinne vil deles tilfeldig i 2 grupper, forutsatt en befruktningsrate på 80 %, vil studiepopulasjonen som skal analyseres være sammensatt av X*2 (hvor X er antall registrerte kvinner) grupper på 2+ oocytter, halvparten dyrket i ett medium og det andre dyrket i det andre mediet. Den mest åpenbare tilnærmingen til analysen av de resulterende dataene er å betrakte det som et sett med X (= antall kvinner) 2x2 tabeller, der mengden som skal estimeres er oddsforholdet for blastulering av ett medium i forhold til det andre, til analyseres ved hjelp av Mantel Haenszel-prosedyren, med kvinne som stratifiseringsfaktor (primæranalyse). Hvis vi antar en total blastulasjonsrate på 34 %, tilsvarer en minimal relevant forskjell på 7 % en oddsratio for blastulation på 1,4. For å detektere med alfa=5 % (2-sidig) og kraft = 80 % et oddsforhold på 1,4, må omtrent 1200 (1182) oocytter inkluderes (Hulley et al., 2013) delt i 2 grupper av like store størrelser , som tilsvarer omtrent 160 - 200 kvinner (ca. 6 oocytter/kvinne hentet og vurderer en befruktningsrate på 80 %).

I sekundær eksplorativ analyse vil en logistisk modell tilpasses dataene med blastulasjon som avhengig binær variabel og kvinne som stratum, for å vurdere den prediktive verdien av ulike prognostiske faktorer og mulige interaksjoner mellom hver av dem og kulturmediet.