培养基和囊胚发育

概括：

在 ART 程序中，囊胚移植可以被认为是最生理的情况，因为胚胎在与自然界最相似的阶段被放置在子宫腔中。 这些潜在的好处促使全世界越来越多的中心从卵裂期胚胎移植转向囊胚期胚胎移植（Maheshwari 等人，2016 年）。 尽管如此，也存在一些潜在的缺点。 这种方法减少了可用胚胎的总数（定义为可用于转移或冷冻保存的胚胎）（Glujovsky 等人，2016 年）。 也有人对这种方法的安全性提出了一些担忧。 特别是，体外培养的持续时间延长可能对胚胎发育产生长期影响。 在最近的一项荟萃​​分析中，囊胚阶段转移实际上与早产（<37 周）、极早产（<32 周）、大于胎龄儿和围产期死亡率的风险增加有关，尽管后者仅从一项研究。 相反，囊胚移植与小于胎龄儿和消失双胞胎的风险降低有关，尽管只有一项研究报告了后者（Martins 等人，2017 年）。

文化媒体在这方面起着至关重要的作用。 已经提出了两种旨在支持胚胎发育至囊胚阶段的不同方法：“回归自然”顺序方法和“让胚胎选择”单一培养基方法（Summers 等人，2003 年；Machtinger 等人，2012 年，奎因 2012）。

顺序培养基系统旨在满足发育中胚胎从第 1 天到第 5 天确定的不断变化的代谢和营养需求（Gardner 等人，1996、1997、1998、1999）。 通过这种方法，胚胎在第一种培养基中生长至第 3 天，然后在卵裂阶段转移到第二种培养基中。 目标是将胚胎暴露于特定阶段的培养基，旨在反映观察到的输卵管与子宫中丙酮酸、乳酸和葡萄糖浓度的变化（Gardner 等人，1996）。

另一方面，单一培养基旨在让发育中的胚胎选择所需的营养，同时最大限度地减少第 3 天暴露于培养环境突然变化的压力。单一培养基可以与培养基变化一起使用在第 3 天，或在第 3 天没有培养基更新的单步不间断培养中 [Biggers et al., 2008]。 比较单一培养基与连续培养基性能的可用数据表明，两种类型的培养基似乎都为发育中的胚胎提供类似的支持（Sfontouris 等人，2017 年）。

研究设计目的

这项非干预性研究的目的是比较两种不同的市售单步培养基（GEMS 和 Irvine 培养基）中每个受精卵母细胞的囊胚形成率。

卵母细胞采集

将进行连续的卵子采集（包括来自不超过 42 岁女性的卵母细胞，呈现 4 到 8 个正常外观的 MII 卵母细胞，并在罗马生殖医学中心 GENERA 接受射精精子 ICSI 治疗）。 为了排除父亲对囊胚形成率的潜在负面影响，将排除所有来自具有手术提取精子和非常严重的寡腺畸形精子症（准备后活动精子计数 <500.000/ml）的夫妇的卵母细胞。 来自参加 PGD 计划的单基因疾病或染色体结构异常患者的卵母细胞也将被排除在外。

据估计，根据中心经验，研究将持续18个月。 知情同意书是一般使用的 GENERA 标准格式。 该研究将由诊所的机构审查委员会批准。

卵母细胞剥脱、评估和注射 所有程序都将根据标准实践进行，无需任何干预。

就在拾取程序之后，通过短暂暴露于 40 IU/ml 透明质酸酶溶液，然后在受控温度环境中使用定义直径的塑料移液管机械去除辐射冠，将卵母细胞从卵丘中剥离。 该程序将在 hCG 给药后 37 至 40 小时之间进行。 然后将中期 II (MII) 卵母细胞与未成熟卵母细胞分离，并在立体显微镜下进行评估。 具有严重形态异常的那些将被认为质量较低（根据 Rienzi 等人，2008），因此将被排除在比较之外。 所有 MII 卵母细胞将被放置在同一个培养皿中。

使用随机化表，将每个患者的卵母细胞随机分成两组，独立授精并随后保存在 2 个单步培养基 GEMS（GERI 培养基）和 Irvine（含 HSA 的连续单一培养物）中。 使用先前描述的技术和仪器（Rienzi 等人，1998）对卵母细胞进行 ICSI。 为了能够跟踪单个卵母细胞的发育进程，来自每组的受精卵母细胞将在单独的培养皿中培养，并且每个个体卵母细胞将根据其在培养皿微孔中的位置进行识别。 胚胎培养将持续至第 5 天，并将在延时培养箱（GERI，Genea）中在含有 6% CO2 和 5% O2 的低氧环境中进行。

胚胎评估

根据 GENERA 程序，将使用形态动力学分析评估胚胎发育过程中各种事件（同配、卵裂、压实和囊胚形成）的详细分析。 将评估各种参数：ICSI 程序结束与同卵结合之间的时间，完成分裂为 2、3、4、5 和 8 个细胞（分别为 T2、T3、T4、T5、T8）；第一、第二和第三个细胞周期（分别为 CC1、CC2 和 CC3）的长度以及从三到四和五到八个细胞（分别是 S2 和 S3）的分裂的同步性。 将根据 Gardner 和 Schoolcraft (1999) 报告的标准进行标准胚泡形态学评估。 简而言之，囊胚将根据扩张程度、内细胞团 (ICM) 和滋养外胚层细胞 (TE) 的质量进行评估。 ICM 根据细胞数量和压实程度进行评估，而 TE 根据细胞的数量、尺寸和上皮的外观（粘性或松散）进行评估。 还将记录与胚泡形成相关的形态动力学参数，特别是：开始压实、开始囊胚形成和完成囊胚形成（分别为 TSC、TSB、TB）。

统计考虑 主要研究终点是囊胚形成率，计算为受精卵的百分比，在任一培养基中培养，在队列的每一半中发育到胚泡阶段。 由于只有获得 4 到 8 个卵母细胞的女性才有资格，并且每个女性的卵母细胞将随机分成两组，假设受精率为 80%，要分析的研究人群将由 X*2 组成（其中 X是登记女性的数量）2+ 卵母细胞组，一半在一种培养基中培养，另一半在第二种培养基中培养。 分析结果数据最明显的方法是将其视为一组 X（= 女性人数）2x2 表格，其中要估计的数量是一种介质相对于另一种介质的比值比，以通过 Mantel Haenszel 程序进行分析，以女性为分层因素（初步分析）。 假设总体囊胚形成率为 34%，则 7% 的最小相关差异对应于囊胚形成的比值比为 1.4。 为了检测 alfa=5%（双侧）和功效 = 80% 的比值比为 1.4，需要包括大约 1200 (1182) 个卵母细胞（Hulley 等人，2013），分成大小相等的 2 组, 这大约相当于 160 - 200 名女性 (aprox. 6 个卵母细胞/女性检索并考虑受精率 80%)。

在二次探索性分析中，逻辑模型将被拟合到以囊胚为因二元变量和女性为层的数据，以评估各种预后因素的预测价值以及它们中的每一个与培养基之间可能的相互作用。