Medios de cultivo y desarrollo de blastocistos

RESUMEN:

En los procedimientos TRA, la transferencia de blastocistos puede considerarse la situación más fisiológica, ya que el embrión se coloca en la cavidad uterina en una etapa muy similar a la que ocurre en la naturaleza. Estos beneficios potenciales han inducido a más y más centros a pasar de la etapa de escisión a la transferencia de embriones en etapa de blastocisto en todo el mundo (Maheshwari et al., 2016). A pesar de esto, también hay algunas desventajas potenciales. Este enfoque disminuye el número total de embriones utilizables (definidos como aquellos disponibles para transferencia o criopreservación) (Glujovsky et al., 2016). También se han planteado algunas preocupaciones con respecto a la seguridad de este enfoque. En particular, la duración prolongada del cultivo in vitro puede tener un efecto a largo plazo en el desarrollo del embrión. En un metaanálisis reciente, la transferencia del estadio de blastocisto se asoció de hecho con mayores riesgos de parto prematuro (<37 semanas), parto muy prematuro (<32 semanas), mortalidad perinatal grande para la edad gestacional, aunque esta última solo se identificó a partir de un estudio. Por el contrario, la transferencia de blastocistos se asoció con una disminución en el riesgo de gemelos pequeños para la edad gestacional y de desaparición de gemelos, aunque esto último solo se informó en un estudio (Martins et al., 2017).

Los medios de cultivo juegan un papel crucial en este contexto. Se han propuesto dos enfoques distintos destinados a apoyar el desarrollo del embrión hasta la etapa de blastocisto: el enfoque secuencial de "regreso a la naturaleza" y el enfoque de medio único "dejar que el embrión elija" (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

El sistema de medios de cultivo secuencial está diseñado para cumplir con los requisitos nutricionales y metabólicos cambiantes identificados del embrión en desarrollo desde el día 1 hasta el día 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Con este enfoque, los embriones se cultivan hasta el día 3 en un primer medio y luego, en la etapa de escisión, se trasladan a un segundo medio. El objetivo es exponer los embriones a medios específicos de etapa, diseñados para reflejar los cambios observados en las concentraciones de piruvato, lactato y glucosa en la trompa de Falopio frente al útero (Gardner et al., 1996).

Por otro lado, los medios de cultivo únicos tienen como objetivo permitir que los embriones en desarrollo elijan los nutrientes que necesitan, mientras que al mismo tiempo minimizan el estrés de la exposición a un cambio abrupto en su entorno de cultivo en el día 3. Los medios únicos se pueden usar con un cambio de medio. en el día 3, o en un cultivo ininterrumpido de un solo paso, en el que no hay renovación del medio en el día 3 [Biggers et al., 2008]. Los datos disponibles que comparan el rendimiento de medios de cultivo únicos frente a medios de cultivo secuenciales sugieren que ambos tipos de medios parecen brindar un apoyo similar al embrión en desarrollo (Sfontouris et al., 2017).

Objetivo del estudio y diseño.

El objetivo de este estudio no intervencionista es comparar la tasa de blastulación por ovocito fertilizado en dos medios de cultivo de un solo paso diferentes disponibles comercialmente (GEMS y medios de cultivo Irvine).

colección de ovocitos

Se realizarán colectas consecutivas de óvulos (con inclusión de ovocitos provenientes de mujer no mayor de 42 años, que presente entre 4 y 8 ovocitos MII de apariencia normal y sometida a tratamiento ICSI con semen eyaculado en el Centro de Medicina Reproductiva GENERA en Roma). Para excluir el posible efecto paterno negativo sobre la tasa de blastulación, se excluirán todos los ovocitos provenientes de parejas con espermatozoides extraídos quirúrgicamente y oligoastenoteratozoospermia muy grave (recuento de espermatozoides móviles <500.000/ml después de la preparación). También se excluirán los ovocitos provenientes de pacientes inscritas en el programa de PGD por enfermedades monogénicas o anomalías cromosómicas estructurales.

Se estima, en base a la experiencia del centro, que el estudio tendrá una duración de 18 meses. El consentimiento informado es el formato estándar de GENERA en uso ordinario. El estudio será aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Clínica.

Denudación, evaluación e inyección de ovocitos Todos los procedimientos se realizarán según la práctica habitual sin ningún tipo de intervención.

Inmediatamente después del procedimiento de recogida, los ovocitos se desprenderán del cúmulo oóforo mediante una exposición breve a una solución de hialuronidasa de 40 UI/ml seguida de la extracción mecánica de la corona radiada con el uso de pipetas de plástico de diámetros definidos en un entorno de temperatura controlada. Este procedimiento se realizará entre las 37 y 40 horas posteriores a la administración de hCG. Luego, los ovocitos en metafase II (MII) se separarán de los ovocitos inmaduros y se evaluarán en el estereomicroscopio. Aquellos con anomalías morfológicas severas serán considerados de menor calidad (según Rienzi et al., 2008) y por lo tanto serán excluidos de la comparación. Todos los ovocitos MII se colocarán en la misma placa de Petri.

Usando tablas de aleatorización, los ovocitos de cada paciente se dividirán aleatoriamente en dos grupos que se inseminarán de forma independiente y posteriormente se mantendrán en 2 medios de cultivo de un solo paso, GEMS (medio GERI) e Irvine (cultivo único continuo completo con HSA). Los ovocitos se someterán a ICSI utilizando técnicas e instrumentaciones descritas anteriormente (Rienzi et al., 1998). Para poder seguir la progresión del desarrollo de los ovocitos individuales, los ovocitos inseminados de cada grupo se cultivarán en placas separadas y cada ovocito individual se identificará según su posición dentro de los micropocillos de las placas. El cultivo de embriones durará hasta el día 5 y se realizará en una incubadora de lapso de tiempo (GERI, Genea) en atmósfera hipóxica que contiene 6% CO2 y 5% O2.

Evaluación de embriones

Según el procedimiento GENERA, se evaluará el análisis detallado de varios eventos durante el desarrollo embrionario (singamia, clivajes, compactación y blastulación) mediante análisis morfocinético. Se evaluarán varios parámetros: tiempo entre el final del procedimiento ICSI y la singamia, finalización de la división en 2, 3, 4, 5 y 8 células (T2, T3, T4, T5, T8, respectivamente); duración del primer, segundo y tercer ciclo celular (CC1, CC2 y CC3 respectivamente) y sincronía en la división de tres a cuatro y de cinco a ocho células (S2 y S3, respectivamente). La evaluación morfológica estándar del blastocisto se realizará de acuerdo con los criterios informados por Gardner y Schoolcraft (1999). En resumen, los blastocistos serán evaluados según el grado de expansión, la calidad de la masa celular interna (ICM) y de las células del trofoectodermo (TE). El ICM se evalúa según el número de células y el grado de compactación, mientras que el TE se evalúa según el número, la dimensión de las células y el aspecto del epitelio (cohesivo o suelto). También se registrarán los parámetros morfocinéticos relacionados con la formación de blastocistos y en particular: inicio de la compactación, inicio de la blastulación y finalización de la blastulación (TSC, TSB, TB, respectivamente).

Consideraciones estadísticas El criterio principal de valoración del estudio es la tasa de blastulación, calculada como el porcentaje de óvulos fertilizados, cultivados en cualquier medio, que se desarrollan hasta el estadio de blastocisto en cada mitad de la cohorte. Dado que solo serán elegibles las mujeres con entre 4 y 8 ovocitos extraídos, y los ovocitos de cada mujer se dividirán aleatoriamente en 2 grupos, asumiendo una tasa de fertilización del 80 %, la población de estudio que se analizará estará compuesta por X*2 (donde X es el número de mujeres inscritas) grupos de 2+ ovocitos, la mitad cultivada en un medio y la otra cultivada en el segundo medio. El enfoque más obvio para el análisis de los datos resultantes es considerarlos como un conjunto de X (= número de mujeres) tablas 2x2, donde la cantidad a estimar es la razón de posibilidades de blastulación de un medio en relación con el otro, para analizarse mediante el procedimiento de Mantel Haenszel, con la mujer como factor de estratificación (análisis primario). Suponiendo una tasa global de blastulación del 34 %, una diferencia mínima relevante del 7 % corresponde a una razón de probabilidad de blastulación de 1,4. Para detectar con alfa=5 % (bilateral) y potencia = 80 % una razón de probabilidad de 1,4, se deben incluir aproximadamente 1200 (1182) ovocitos (Hulley et al., 2013) divididos en 2 grupos de igual tamaño , que corresponden aproximadamente a 160 - 200 mujeres (aprox. 6 ovocitos/mujer recuperados y considerando una tasa de fecundación del 80%).

En el análisis exploratorio secundario, se ajustará a los datos un modelo logístico con blastulación como variable binaria dependiente y mujer como estrato, para evaluar el valor predictivo de diversos factores pronósticos y las posibles interacciones entre cada uno de ellos y el medio de cultivo.