Cultuurmedia en ontwikkeling van blastocysten

SAMENVATTING:

Bij ART-procedures kan de overdracht van blastocysten worden beschouwd als de meest fysiologische situatie, aangezien het embryo in de baarmoederholte wordt geplaatst in een stadium dat het meest lijkt op dat wat in de natuur voorkomt. Deze potentiële voordelen hebben ertoe geleid dat steeds meer centra over de hele wereld van het splitsingsstadium naar het blastocyststadium zijn verhuisd (Maheshwari et al., 2016). Desondanks zijn er ook enkele mogelijke nadelen. Deze benadering vermindert het totale aantal bruikbare embryo's (gedefinieerd als de embryo's die beschikbaar zijn voor terugplaatsing of cryopreservatie) (Glujovsky et al., 2016). Er zijn ook enkele zorgen geuit over de veiligheid van deze aanpak. Met name de verlengde duur van de in vitro kweek kan een langdurig effect hebben op de ontwikkeling van het embryo. In een recente meta-analyse werd de overdracht van het blastocyststadium in feite geassocieerd met een verhoogd risico op vroeggeboorte (<37 weken), zeer vroeggeboorte (<32 weken), groot voor de zwangerschapsduur en perinatale sterfte, hoewel dit laatste alleen werd vastgesteld op basis van één studie. Omgekeerd ging de overdracht van blastocysten gepaard met een afname van het risico op kleine zwangerschapsduur en verdwijnende tweelingen, hoewel dit laatste slechts in één onderzoek werd gerapporteerd (Martins et al., 2017).

Cultuurmedia spelen daarbij een cruciale rol. Er zijn twee verschillende benaderingen voorgesteld ter ondersteuning van de embryo-ontwikkeling tot het blastocyststadium: de sequentiële "terug naar de natuur"-benadering en de "laat het embryo kiezen"-benadering met één medium (Summers et al., 2003; Machtinger et al., 2012, Quinn 2012).

Het sequentiële kweekmediasysteem is ontworpen om te voldoen aan geïdentificeerde veranderende metabole en voedingsbehoeften van het zich ontwikkelende embryo van dag 1 tot dag 5 (Gardner et al. 1996, 1997, 1998, 1999). Met deze benadering worden embryo's tot dag 3 gekweekt in een eerste medium en vervolgens, in het splitsingsstadium, naar een tweede medium verplaatst. Het doel is om de embryo's bloot te stellen aan stadiumspecifieke media, ontworpen om waargenomen veranderingen in concentraties van pyruvaat, lactaat en glucose in de eileider versus de baarmoeder weer te geven (Gardner et al., 1996).

Aan de andere kant zijn enkelvoudige kweekmedia bedoeld om ontwikkelende embryo's in staat te stellen de voedingsstoffen te kiezen die ze nodig hebben, terwijl tegelijkertijd de stress door blootstelling aan een abrupte verandering in hun kweekomgeving op dag 3 wordt geminimaliseerd. Enkelvoudige media kunnen worden gebruikt met een mediumwissel op dag 3, of in een single-step ononderbroken cultuur, waarin er geen medium verversing is op dag 3 [Biggers et al., 2008]. Beschikbare gegevens die de prestaties van enkelvoudige versus sequentiële kweekmedia vergelijken, suggereren dat beide soorten media vergelijkbare ondersteuning lijken te bieden aan het zich ontwikkelende embryo (Sfontouris et al., 2017).

Doel van het onderzoek en ontwerp

Het doel van deze niet-interventionele studie is om de blastulatiesnelheid per bevruchte oöcyt te vergelijken in twee verschillende in de handel verkrijgbare single-step kweekmedia (GEMS en Irvine kweekmedia).

Eicel collectie

Opeenvolgende eicelverzameling zal worden uitgevoerd (inclusief oöcyten afkomstig van een vrouw die niet ouder is dan 42 jaar, met tussen de 4 en 8 normaal ogende MII-oöcyten en een ICSI-behandeling met geëjaculeerd sperma in het Centrum voor Reproductieve Geneeskunde GENERA in Rome). Om een ​​mogelijk negatief vaderlijk effect op de blastulatiesnelheid uit te sluiten, worden alle oöcyten die afkomstig zijn van paren met chirurgisch geëxtraheerde spermatozoa en zeer ernstige oligoastenoteratozoöspermie (aantal beweeglijke zaadcellen <500.000/ml na preparatie) uitgesloten. Eicellen die afkomstig zijn van patiënten die deelnemen aan het PGD-programma voor monogene ziekten of structurele chromosomale afwijkingen, worden ook uitgesloten.

Op basis van de ervaring van het centrum zal de studie naar schatting 18 maanden duren. De geïnformeerde toestemming is het standaardformaat van GENERA bij normaal gebruik. De studie zal worden goedgekeurd door de Institutional Review Board van de kliniek.

Oöcyt denudatie, evaluatie en injectie Alle procedures worden uitgevoerd volgens de standaardpraktijk zonder enige vorm van tussenkomst.

Net na de pick-upprocedure worden oöcyten van de cumulus oophorus ontdaan door een korte blootstelling aan 40 IE/ml hyaluronidase-oplossing, gevolgd door mechanische verwijdering van de corona radiata met behulp van plastic pipetten met gedefinieerde diameters in een gecontroleerde temperatuuromgeving. Deze procedure wordt tussen 37 en 40 uur na hCG-toediening uitgevoerd. Metafase II (MII)-oöcyten worden vervolgens gescheiden van de onrijpe oöcyten en geëvalueerd met de stereomicroscoop. Degenen met ernstige morfologische afwijkingen zullen worden beschouwd als van mindere kwaliteit (volgens Rienzi et al., 2008) en zullen dus worden uitgesloten van vergelijking. Alle MII-eicellen worden in dezelfde petrischaal geplaatst.

Met behulp van randomisatietabellen worden eicellen van elke patiënt willekeurig verdeeld in twee groepen die onafhankelijk worden geïnsemineerd en vervolgens worden bewaard in 2 single-step kweekmedia, GEMS (GERI Medium) en Irvine (Continuous Single Culture Complete with HSA). Eicellen zullen worden onderworpen aan ICSI met behulp van eerder beschreven technieken en instrumenten (Rienzi et al., 1998). Om de ontwikkelingsprogressie van individuele oöcyten te kunnen volgen, zullen geïnsemineerde oöcyten van elke groep in afzonderlijke schalen worden gekweekt en zal elke individuele oöcyt worden geïdentificeerd op basis van zijn positie in de microwells van de schaal. De embryokweek duurt tot dag 5 en wordt uitgevoerd in een time-lapse-incubator (GERI, Genea) in een hypoxische atmosfeer met 6% CO2 en 5% O2.

Embryo beoordeling

Volgens de GENERA-procedure zal een gedetailleerde analyse van verschillende gebeurtenissen tijdens de ontwikkeling van het embryo (syngamie, splitsingen, verdichting en blastulatie) worden beoordeeld met behulp van morfokinetische analyse. Verschillende parameters zullen worden beoordeeld: tijd tussen het einde van de ICSI-procedure en syngamie, voltooiing van de splitsing tot 2, 3, 4, 5 en 8 cellen (respectievelijk T2, T3, T4, T5, T8); lengte van de eerste, tweede en derde celcyclus (respectievelijk CC1, CC2 en CC3) en synchronie in de deling van drie naar vier en vijf naar acht cellen (respectievelijk S2 en S3). Standaard morfologische beoordeling van de blastocyst zal worden uitgevoerd volgens de criteria gerapporteerd door Gardner en Schoolcraft (1999). In het kort zullen de blastocysten beoordeeld worden op de mate van expansie, kwaliteit van de binnenste celmassa (ICM) en van de trophectodermcellen (TE). De ICM wordt beoordeeld op basis van het aantal cellen en de mate van verdichting, terwijl de TE wordt beoordeeld op basis van het aantal, de afmetingen van de cellen en het uiterlijk van het epitheel (samenhangend of los). Morfokinetische parameters die verband houden met de vorming van blastocysten zullen ook worden geregistreerd en in het bijzonder: initiatie van verdichting, initiatie van blastulatie en voltooiing van blastulatie (respectievelijk TSC, TSB, TB).

Statistische overwegingen Het primaire eindpunt van de studie is de blastulatiesnelheid, berekend als het percentage bevruchte eicellen, gekweekt in elk medium, die zich ontwikkelen tot het blastocyststadium in elke helft van het cohort. Aangezien alleen vrouwen met tussen de 4 en 8 gewonnen eicellen in aanmerking komen, en de eicellen van elke vrouw willekeurig in 2 groepen zullen worden verdeeld, uitgaande van een bevruchtingspercentage van 80%, zal de te analyseren onderzoekspopulatie worden samengesteld uit X*2 (waarbij X is het aantal geregistreerde vrouwen) groepen van 2+ oöcyten, de helft gekweekt in één medium en de andere gekweekt in het tweede medium. De meest voor de hand liggende benadering van de analyse van de resulterende gegevens is om deze te beschouwen als een set van X (= aantal vrouwen) 2x2 tabellen, waarbij de te schatten hoeveelheid de odds ratio is van blastulatie van het ene medium ten opzichte van het andere, om worden geanalyseerd met behulp van de Mantel Haenszel-procedure, met vrouw als stratificatiefactor (primaire analyse). Uitgaande van een totale blastulatiegraad van 34% komt een minimaal relevant verschil van 7% overeen met een odds ratio van blastulatie van 1,4. Om met alfa=5% (2-zijdig) en power = 80% een odds ratio van 1,4 te detecteren, moeten ongeveer 1200 (1182) oöcyten worden opgenomen (Hulley et al., 2013) verdeeld over 2 groepen van gelijke grootte , dat komt ongeveer overeen met 160 - 200 vrouwen (ca. 6 oöcyten/vrouw teruggevonden en rekening houdend met een bevruchtingsgraad van 80%).

In secundaire verkennende analyse zal een logistiek model op de gegevens worden aangepast met blastulatie als de afhankelijke binaire variabele en vrouw als stratum, om de voorspellende waarde van verschillende prognostische factoren en de mogelijke interacties tussen elk van hen en het kweekmedium te beoordelen.