C.ディフィシル毒素の血清レベルとC.ディフィシル感染との関係

バックグラウンド。 C. difficile はしばしば中毒症を誘発しますが、既存の診断ツールの感度が限られているため、一般的な臨床診療では検出されません。 検出されていませんが、クロストリジウム ディフィシル感染症 (CDI) による中毒血症がしばしば経験されており、これが生命を脅かす CDI 症例の全身性合併症を説明しています。 最近まで、発病過程はすでに知られていましたが、C. difficile 毒素によって引き起こされる腸外損傷の現象は過小評価されてきました。 しかし、最近の研究では、人間の毒血症が証明されています。 過去 5 年間の動物実験では、いくつかの体液に C. difficile 毒素が存在することが証明されており、中毒症は全身​​疾患および死亡率と相関しています。 ただし、トキシン A (TcdA) およびトキシン B (TcdB) は C. difficile 関連の下痢および炎症の原因となる主要な病原性因子ですが、これまでにヒトで報告された毒血症陽性の症例は 3 例 (成人 2 例および小児 1 例) のみです。 このように毒素血症陽性の症例数が少ない理由は、感受性の高い毒素検出方法が欠如しているためかもしれません。

目的。

1. CD 毒素の血清レベルと CDI の重症度/失敗のグレードと CDI 治療の失敗および再発率との関連を評価すること。
2. 抗CDI治療を受けているCDI患者の血清中のCD毒素の動態を評価すること。
3. 血清毒素レベルと CDI 下痢の長さとの関係を評価すること。

デザインを研究します。 CDI患者におけるCD毒素の血清レベルの測定に関する前向き観察研究。

クロストリジウム・ディフィシル毒素の血清レベルと重症度および再発率との関係を評価するために、軽度から中等度の CDI の 20 人、重度の CDI の 20 人、重度の複雑性/劇症の 5 人を含む、CDI 感染が記録されている連続した 45 人の患者を研究します。 ESCMID 定義による CDI。 各患者について、0時(抗CDI治療の開始前)、4日、10日の時点で血清毒素の3回の測定を実施する。

患者は、最初のエピソードからの回復後 3 か月まで追跡されます。

血清毒素のレベルは、重症度と最初の再発に相関します。

方法論

1. 血清サンプル 各健常者および CDI 対象から末梢血を採取します。 血清は、700 g で 5 分間の遠心分離によって末梢血サンプルから分離され、測定まで -20 °C で保存されます。
2. 血清 IgG 枯渇 ヒト血清に存在する中和抗体 (主に IgG) は、血清中の C. difficile 毒素レベルをマスクできることが報告されています。 血清サンプル中の総 IgG は、Protein A ビーズ (Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA) で除去されます。 2ミリリットルのヒト血清サンプルを、結合バッファーに再懸濁した等量のプロテインAビーズに適用し、室温で回転攪拌しながら1時間インキュベートします。 プロテイン A ビーズに結合した IgG は、遠心分離によって除去されます。 適切な IgG の枯渇は、ウエスタンブロットによって評価されます。
3. SDS-PAGE およびウエスタンブロット IgG 精製血清を 10% SDS-PAGE で分離し、PVDF 膜 (Bio-Rad、Hercules、CA、USA) に転写します。 室温 (RT) で 1 時間、PBS に溶解した 5% 脱脂粉乳 (w/v) および 0.5% Tween-20 (v/v) でブロッキングした後、メンブレンを抗ヒト IgG 一次抗体でプローブします。 (抗ヒト IgG、γ 鎖特異的抗体; Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)、4°C で一晩。 次に、膜をHRP結合二次抗体（Bio-Rad）とともにRTで1時間インキュベートします。 強化化学発光 (ECL) 検出システム (Bio-Rad) によってタンパク質を視覚化し、Chemidoc System (Bio-Rad) を使用して画像を取得します。
4. ドットブロット

d1. 標準参照 ヒト血清試料中のＣ．ディフィシレＴｃｄＡおよびＴｃｄＢレベルの評価のためのドットブロット条件設定は、以下のように実施される。 組換えＴｃｄＡおよびＴｃｄＢ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）を脱イオン水に溶解して、０．２ｍｇ／ｍＬストック溶液を得る。 毒素は、pH 7.4 の PBS で 0.001 pg から 1000 pg まで連続希釈されます。 10 マイクロリットルの希釈 TcdA および TcdB を 3 通で EMD Millipore MultiScreen™ 96 ウェル アッセイ プレート (Fisher Scientific、Waltham、MA、USA) にブロットします。 10 分間乾燥させた後、メンブレンを 2% BSA-PBS (w/v) バッファーに 37 °C で 1 時間浸します。 ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）で膜を２分間洗浄し、抗Ｃ． difficile TcdAおよび抗C.difficile TcdB (Abcam) 一次抗体 (ネイティブタンパク質を認識する)、室温で 1 時間。 製造元の指示に従って、抗 TcdA および抗 TcdB 抗体の適切な希釈をテストします。 次いで膜を２分間洗浄し、増加する濃度のＴｃｄＡおよびＴｃｄＢに対応するドットをＥＣＬによって視覚化し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃシステムによって取得する。 色のしみの強度は、この方法で検出できる TcdA と TcdB の最小濃度を評価するための標準参照と見なされます。

d2.使用するヒト血清の量と希釈度の設定 メソッドの感度は、組み換え毒素を加えて新たに調製した毒素血症陰性のスパイクヒト血清サンプル（陽性対照）を使用して評価されます。 スパイクされた血清に添加される組換え TcdA および TcdB の量は、前のセクション (d1) で得られた結果に基づいて選択されます。 これにより、次の決定が可能になります。(i) ヒト血清で希釈した場合にドットブロット法で検出できる TcdA および TcdB の最小濃度。 (ii) MultiScreen™ 96 ウェル アッセイ プレートの各ウェルに添加するヒト血清の適切な量と希釈率。

d3.毒素レベルを決定するための CDI 患者の血清サンプルのドットブロット CDI 患者由来のヒト血清を IgG 除去し (セクション b を参照)、MultiScreen™ 96 ウェルアッセイプレートに 3 回スポットします。 セクション d1 で説明したドットブロット法を適用して、TcdA および TcdB 標準曲線を使用して、TcdA および TcdB レベルを決定および半定量化します。