Relación entre el nivel sérico de toxinas de C. difficile con la infección por C. difficile

Fondo. C. difficile frecuentemente induce toxemia; sin embargo, debido a la sensibilidad limitada de las herramientas de diagnóstico existentes, no se detecta en la práctica clínica común. Aunque no se detecta, la toxemia inducida por la infección por Clostridium difficile (CDI) a menudo se experimenta, y esto explica las complicaciones sistémicas de los casos de CDI que amenazan la vida. Hasta hace poco tiempo, aunque ya se conocía el proceso patogénico, se ha infravalorado el fenómeno del daño extraintestinal causado por las toxinas de C. difficile. Sin embargo, un estudio reciente ha demostrado toxemia en humanos. En los últimos 5 años, estudios en animales han demostrado la presencia de toxinas de C. difficile en varios fluidos corporales, correlacionándose la toxemia con enfermedad sistémica y mortalidad. Sin embargo, aunque la toxina A (TcdA) y B (TcdB) son los principales factores de virulencia responsables de la diarrea y la inflamación asociadas con C. difficile, hasta ahora solo se han informado tres casos positivos para toxemia (dos adultos y un niño) en humanos. La explicación de un número tan bajo de casos positivos para toxemia puede ser la falta de un método sensible de detección de toxinas.

Objetivos.

1. Evaluar la asociación entre los niveles séricos de toxinas de CD y el grado de gravedad de la ICD/fracaso del tratamiento de la ICD y la tasa de recurrencia.
2. Evaluar la cinética de las toxinas CD en suero de pacientes con CDI que reciben tratamiento anti-CDI.
3. Evaluar la relación entre los niveles de toxinas séricas y la duración de la diarrea CDI.

Diseño del estudio. Estudio observacional prospectivo sobre la medida de los niveles séricos de toxinas CD en pacientes con ICD.

Con el fin de evaluar la relación entre el nivel sérico de las toxinas de C. difficile y la gravedad y la tasa de recurrencia, se estudiarán 45 pacientes consecutivos con infección por CDI documentada, incluidos 20 con CDI leve-moderada, 20 con CDI grave y 5 con CDI grave complicada/fulminante. CDI según definición ESCMID. Para cada paciente se realizarán tres determinaciones de toxinas séricas en el tiempo 0 (antes de iniciar el tratamiento anti-CDI), 4d, 10d.

Los pacientes serán seguidos hasta tres meses después de la recuperación del primer episodio.

Los niveles de toxinas séricas se correlacionarán con la gravedad y con la primera recurrencia.

Metodología

1. Se obtendrán muestras de suero de sangre periférica de cada sujeto sano y CDI. El suero se separará de la muestra de sangre periférica mediante centrifugación a 700 g durante 5 min y luego se almacenará a -20 °C hasta la medición.
2. Depleción de IgG en suero Se ha informado que los anticuerpos neutralizantes presentes en el suero humano, en su mayoría IgG, son capaces de enmascarar los niveles de toxinas de C. difficile en el suero. La IgG total en las muestras de suero se eliminará con perlas de Proteína A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.). Se aplicarán dos mililitros de muestra de suero humano a un volumen igual de perlas de proteína A resuspendidas en tampón de unión y se incubarán a temperatura ambiente con agitación rotatoria durante 1 h. La IgG unida a las perlas de Proteína A se eliminará mediante centrifugación. El agotamiento adecuado de IgG se evaluará mediante western blot.
3. Los sueros purificados con SDS-PAGE y western blot con IgG se resolverán mediante SDS-PAGE al 10 % y se transferirán a membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Después de bloquear durante 1 h a temperatura ambiente (RT) con leche en polvo sin grasa al 5 % (p/v) y Tween-20 al 0,5 % (v/v) disuelto en PBS, las membranas se sondarán con anticuerpo primario IgG antihumano. (Anti-IgG humana, anticuerpo específico de cadena γ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), a 4 °C durante la noche. A continuación, las membranas se incubarán durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con HRP (Bio-Rad). Las proteínas se visualizarán mediante el sistema de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Bio-Rad) y las imágenes se adquirirán mediante el sistema Chemidoc (Bio-Rad).
4. mancha de puntos

d1. Referencia estándar La configuración de la transferencia de puntos para la evaluación de los niveles de TcdA y TcdB de C. difficile en las muestras de suero humano se realizará de la siguiente manera. Se disolverán TcdA y TcdB recombinantes (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) en agua desionizada para obtener soluciones madre de 0,2 mg/ml. Las toxinas se diluirán en serie desde 0,001 pg hasta 1000 pg en PBS a pH 7,4. Se transferirán diez microlitros de TcdA y TcdB diluidos por triplicado en placas de ensayo de 96 pocillos EMD Millipore MultiScreen™ (Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Después de 10 min de secado, la membrana se sumergirá en tampón BSA-PBS al 2 % (p/v) durante 1 h a 37 °C. La membrana se lavará con PBS que contiene Tween 20 al 0,05%, a pH 7,2) durante 2 min y se sumergirá en anti-C. difficile TcdA y anti-C.difficile Anticuerpos primarios TcdB (Abcam) (que reconocen las proteínas nativas), durante 1 hora a temperatura ambiente. Se probará la dilución adecuada de los anticuerpos anti-TcdA y -TcdB, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, la membrana se lavará durante 2 minutos y los puntos correspondientes a las concentraciones crecientes de TcdA y TcdB serán visualizados por ECL y adquiridos por el sistema Chemidoc. Las intensidades de las manchas de color se considerarán como una referencia estándar para evaluar la concentración mínima de TcdA y TcdB que se puede detectar con este método.

d2. Configuración del volumen y la dilución del suero humano que se utilizará La sensibilidad del método se evaluará utilizando muestras de suero humano enriquecidas negativas para toxemia recién preparadas mediante la adición de toxinas recombinantes (control positivo). La cantidad de TcdA y TcdB recombinantes a añadir al suero enriquecido se elegirá en función de los resultados obtenidos en el apartado anterior (d1). Esto permitirá determinar: (i) la concentración mínima de TcdA y TcdB que puede detectarse mediante el método dot-blot cuando se diluye en el suero humano; y (ii) el volumen y la dilución adecuados del suero humano que se agregará a cada pocillo de las placas de ensayo de 96 pocillos MultiScreen™.

d3. Transferencia de puntos en las muestras de suero de pacientes con CDI para determinar los niveles de toxinas Los sueros humanos derivados de pacientes con CDI se eliminarán de IgG (consulte la sección b) y luego se colocarán tres veces en las placas de ensayo de 96 pocillos MultiScreen™. Se aplicará el método dot-blot descrito en la sección d1 para determinar y semicuantificar los niveles de TcdA y TcdB, utilizando las curvas estándar de TcdA y TcdB.