艰难梭菌毒素血清水平与艰难梭菌感染的关系

背景。艰难梭菌经常诱发毒血症，但由于现有诊断工具的敏感性有限，在常见的临床实践中未被发现。 尽管未被发现，但艰难梭菌感染 (CDI) 引起的毒血症经常发生，这解释了危及生命的 CDI 病例的全身并发症。 直到最近，尽管发病过程已为人所知，但艰难梭菌毒素引起的肠外损伤现象一直被低估。 然而，最近的一项研究证明了人类的毒血症。 在过去的 5 年中，动物研究已经证明在几种体液中存在艰难梭菌毒素，毒血症与全身性疾病和死亡率相关。 然而，尽管毒素 A (TcdA) 和 B (TcdB) 是导致艰难梭菌相关腹泻和炎症的主要毒力因子，但迄今为止人类仅报告了三例毒血症阳性病例（两名成人和一名儿童）。 如此少的毒血症阳性病例的解释可能是缺乏敏感的毒素检测方法。

目标。

1. 评估 CD 毒素血清水平与 CDI 严重程度等级/CDI 治疗失败和复发率之间的关联。
2. 评估接受抗 CDI 治疗的 CDI 患者血清中 CD 毒素的动力学。
3. 评估血清毒素水平与 CDI 腹泻持续时间之间的关系。

学习规划。 CDI患者血清CD毒素水平测定的前瞻性观察研究

为了评估艰难梭菌毒素的血清水平与严重程度和复发率之间的关系，将对 45 名有 CDI 感染记录的连续患者进行研究，其中 20 名患有轻中度 CDI，20 名患有重度 CDI，5 名患有严重并发/暴发性 CDI根据 ESCMID 定义的 CDI。 对于每位患者，将在时间 0（开始抗 CDI 治疗之前）、4d、10d 进行三次血清毒素测定。

从第一次发作恢复后，将对患者进行长达三个月的随访。

血清毒素的水平将与严重程度和第一次复发相关。

方法

1. 血清样品 外周血将从每个健康和 CDI 受试者获得。 通过以 700 g 离心 5 分钟从外周血样本中分离出血清，然后在-20°C 下保存直至测量。
2. 血清 IgG 耗竭 据报道，人血清中存在的中和抗体（主要是 IgG）能够掩盖血清中的艰难梭菌毒素水平。 血清样品中的总 IgG 将用蛋白 A 珠（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）去除。 将两毫升人血清样品加到等体积重悬于结合缓冲液中的蛋白 A 珠上，并在室温下旋转搅拌孵育 1 小时。 与蛋白 A 珠结合的 IgG 将通过离心去除。 适当的 IgG 消耗将通过蛋白质印迹评估。
3. SDS-PAGE 和蛋白质印迹 IgG 纯化的血清将通过 10% SDS-PAGE 分离并转移到 PVDF 膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上。 在室温 (RT) 用溶解在 PBS 中的 5% 脱脂奶粉 (w/v) 和 0.5% Tween-20 (v/v) 封闭 1 小时后，将用抗人 IgG 一抗检测膜（抗人 IgG，γ 链特异性抗体；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），4°C 过夜。 然后将膜与 HRP 缀合的二抗 (Bio-Rad) 在室温下孵育 1 小时。 蛋白质将通过增强化学发光 (ECL) 检测系统 (Bio-Rad) 进行可视化，并将使用 Chemidoc 系统 (Bio-Rad) 获取图像。
4. 斑点印迹

d1. 标准参考 用于评估人血清样品中艰难梭菌 TcdA 和 TcdB 水平的斑点印迹条件设置将如下进行。 将重组的 TcdA 和 TcdB（Enzo Life Science, Farmingdale, NY）溶解在去离子水中以获得 0.2 mg/mL 储备溶液。 毒素将在 pH 7.4 的 PBS 中从 0.001 pg 连续稀释到 1000 pg。 将 10 微升稀释的 TcdA 和 TcdB 一式三份印迹到 EMD Millipore MultiScreen™ 96 孔检测板（Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中。 干燥 10 分钟后，膜将在 37°C 下浸入 2% BSA-PBS（w/v）缓冲液中 1 小时。 膜将用含有 0.05% Tween 20 的 PBS 在 pH 7.2 下洗涤 2 分钟并浸入抗 C 中。 艰难梭菌TcdA和抗艰难梭菌 TcdB (Abcam) 一抗（识别天然蛋白质），室温下 1 小时。 根据制造商的说明，将测试抗 TcdA 和 -TcdB 抗体的适当稀释度。 然后将膜清洗 2 分钟，对应于浓度增加的 TcdA 和 TcdB 的点将通过 ECL 可视化并通过 Chemidoc 系统获取。 彩色印迹的强度将被视为标准参考，以评估可通过该方法检测到的 TcdA 和 TcdB 的最低浓度。

d2.设置要使用的人血清的体积和稀释度 该方法的灵敏度将使用通过添加重组毒素新鲜制备的毒血症阴性加标人血清样品（阳性对照）进行评估。 要添加到加标血清中的重组 TcdA 和 TcdB 的数量将根据上一节 (d1) 中获得的结果来选择。 这将允许确定：(i) 在人血清中稀释时可以通过斑点印迹法检测到的 TcdA 和 TcdB 的最低浓度； (ii) 将适当体积和稀释度的人血清添加到 MultiScreen™ 96 孔检测板的每个孔中。

d3.在 CDI 患者的血清样品上进行斑点印迹以确定毒素水平 来自 CDI 患者的人血清将被去除 IgG（参见 b 部分），然后将三次点样到 MultiScreen™ 96 孔检测板中。 d1 部分中描述的点印迹法将用于确定和半量化 TcdA 和 TcdB 水平，使用 TcdA 和 TcdB 标准曲线。