Forholdet mellom C. Difficile-toksiners serumnivå med C. Difficile-infeksjon

Bakgrunn. C. difficile induserer ofte toksemi, men på grunn av begrenset følsomhet til eksisterende diagnostiske verktøy, blir det uoppdaget i vanlig klinisk praksis. Selv om det ikke oppdages, oppleves Clostridium difficile-infeksjon (CDI)-indusert toksemi ofte, og dette forklarer de systemiske komplikasjonene til livstruende CDI-tilfeller. Inntil nylig, selv om den patogenetiske prosessen allerede var kjent, har fenomenet ekstraintestinal skade forårsaket av C. difficile-toksiner vært undervurdert. Imidlertid har en fersk studie påvist toksemi hos mennesker. I løpet av de siste 5 årene har dyrestudier påvist tilstedeværelsen av C. difficile-toksiner i flere kroppsvæsker, toksemi som korrelerer med systemisk sykdom og dødelighet. Men selv om toksin A (TcdA) og B (TcdB) er de primære virulensfaktorene som er ansvarlige for C. difficile-assosiert diaré og betennelse, har bare tre toksemipositive tilfeller (to voksne og ett barn) blitt rapportert så langt hos mennesker. Forklaringen på et så lavt antall toksemipositive tilfeller kan være mangelen på sensitive toksindeteksjonsmetoden.

Mål.

1. For å vurdere sammenhengen mellom CD-toksiners serumnivåer og grad av CDI-alvorlighet/svikt ved CDI-behandling og hyppighet av tilbakefall.
2. For å evaluere kinetikken til CD-toksiner i serum fra CDI-pasienter som gjennomgår anti-CDI-behandling.
3. For å vurdere forholdet mellom serumtoksinnivåer og lengden på CDI-diaré.

Studere design. Prospektiv observasjonsstudie på måling av serumnivåer av CD-toksiner hos pasienter med CDI.

For å vurdere sammenhengen mellom C difficile toksiners serumnivå og alvorlighetsgrad og residivrate, vil 45 påfølgende pasienter med dokumentert CDI-infeksjon bli studert, inkludert 20 med mild-moderat CDI, 20 med alvorlig CDI, og 5 med alvorlig komplisert/fulminant. CDI i henhold til ESCMID-definisjonen. For hver pasient vil det bli utført tre bestemmelse av serumtoksiner på tidspunkt 0 (før oppstart av anti-CDI-behandling), 4d, 10d.

Pasientene vil bli fulgt opp til tre måneder etter bedring fra første episode.

Nivåene av serumtoksinene vil være korrelert med alvorlighetsgrad og til det første tilbakefall.

Metodikk

1. Serumprøver Perifert blod vil bli tatt fra hver frisk og CDI-person. Serum vil bli separert fra den perifere blodprøven ved sentrifugering ved 700 g i 5 minutter, og deretter lagret ved -20 °C frem til måling.
2. Serum-IgG-utarming Det er rapportert at nøytraliserende antistoffer som finnes i humant serum, for det meste IgG, er i stand til å maskere C. difficile-toksinnivåene i serum. Totalt IgG i serumprøver vil bli fjernet med Protein A-kuler (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). To milliliter human serumprøve vil bli påført et likt volum av protein A-kuler resuspendert i bindingsbuffer, og inkubert ved romtemperatur under roterende omrøring i 1 time. IgG bundet til protein A-kulene vil bli fjernet ved sentrifugering. Riktig IgG-depletering vil bli evaluert med western blot.
3. SDS-PAGE og western blot IgG-renset sera vil bli løst med 10 % SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Etter blokkering i 1 time ved romtemperatur (RT) med 5 % fettfri tørrmelk (w/v) og 0,5 % Tween-20 (v/v) oppløst i PBS, vil membraner bli probet med anti-humant IgG primært antistoff (anti-humant IgG, y-kjede spesifikt antistoff; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ved 4°C over natten. Membraner vil deretter bli inkubert i 1 time ved romtemperatur med det HRP-konjugerte sekundære antistoffet (Bio-Rad). Proteiner vil bli visualisert av det forbedrede kjemiluminescens (ECL) deteksjonssystemet (Bio-Rad) og bilder vil bli anskaffet ved hjelp av Chemidoc System (Bio-Rad).
4. Dot-blot

d1. Standardreferanse Dot-blot-tilstanden for evaluering av C. difficile TcdA- og TcdB-nivåer i humane serumprøver vil bli utført som følger. Rekombinant TcdA og TcdB (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) vil bli oppløst i avionisert vann for å oppnå 0,2 mg/ml stamløsninger. Toksiner vil bli seriefortynnet fra 0,001 pg til 1000 pg i PBS ved pH 7,4. Ti mikroliter fortynnet TcdA og TcdB vil bli blottet i tre eksemplarer i EMD Millipore MultiScreen™ 96-brønns analyseplater (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Etter 10 minutter med tørking, vil membranen nedsenkes i 2% BSA-PBS (w/v) buffer i 1 time ved 37 °C. Membranen vil bli vasket med PBS inneholdende 0,05 % Tween 20, ved pH 7,2) i 2 minutter og nedsenket i anti-C. difficile TcdA og anti-C.difficile TcdB (Abcam) primære antistoffer (gjenkjenner de native proteinene), i 1 time ved RT. Riktig fortynning av anti-TcdA- og -TcdB-antistoffene vil bli testet i henhold til produsentens instruksjoner. Membranen vil deretter vaskes i 2 minutter, og prikkene som tilsvarer de økende konsentrasjonene av TcdA og TcdB vil bli visualisert av ECL og ervervet av Chemidoc-systemet. Intensiteten til de fargede blottene vil bli betraktet som en standardreferanse for å evaluere minimumskonsentrasjonen av TcdA og TcdB som kan påvises med denne metoden.

d2. Oppsett av volumet og fortynningen av humant serum som skal brukes. Sensitiviteten til metoden vil bli vurdert ved bruk av tokseminegative tilsatt humane serumprøver ferskt tilberedt ved tilsetning av rekombinante toksiner (positiv kontroll). Mengden rekombinant TcdA og TcdB som skal tilsettes til tilsatt serum vil bli valgt på grunnlag av resultatene oppnådd i forrige avsnitt (d1). Dette vil tillate å bestemme: (i) den minimale konsentrasjonen av TcdA og TcdB som kan påvises ved dot-blot-metoden når den fortynnes i humant serum; og (ii) riktig volum og fortynning av det humane serumet som skal tilsettes til hver brønn på MultiScreen™ 96-brønners analyseplater.

d3. Dot blot på serumprøvene fra CDI-pasienter for å bestemme toksinnivåer. Humant sera avledet fra CDI-pasienter vil bli IgG-depletert (se avsnitt b) og deretter flekket tre ganger i MultiScreen™ 96-brønns analyseplater. Dot-blot-metoden beskrevet i seksjon d1 vil bli brukt for å bestemme og semikvantifisere TcdA- og TcdB-nivåer ved å bruke TcdA- og TcdB-standardkurvene.