Forholdet mellem C. Difficile-toksiners serumniveau med C. Difficile-infektion

Baggrund. C. difficile inducerer ofte toksæmi, men på grund af begrænset følsomhed af eksisterende diagnostiske værktøjer, bliver det uopdaget i almindelig klinisk praksis. Selvom det ikke er opdaget, opleves Clostridium difficile-infektion (CDI)-induceret toksæmi ofte, og dette forklarer de systemiske komplikationer af livstruende CDI-tilfælde. Indtil for nylig, selvom den patogenetiske proces allerede var kendt, har fænomenet ekstraintestinale skader forårsaget af C. difficile-toksiner været undervurderet. Imidlertid har en nylig undersøgelse påvist toksæmi hos mennesker. I de sidste 5 år har dyreforsøg påvist tilstedeværelsen af ​​C. difficile-toksiner i flere kropsvæsker, toksæmi korreleret med systemisk sygdom og dødelighed. Men selvom toksin A (TcdA) og B (TcdB) er de primære virulensfaktorer, der er ansvarlige for C. difficile-associeret diarré og inflammation, er der indtil videre kun rapporteret tre toksæmi-positive tilfælde (to voksne og et barn) hos mennesker. Forklaringen på et så lavt antal toksæmipositive tilfælde kan være manglen på følsomme toksinpåvisningsmetode.

Mål.

1. At vurdere sammenhængen mellem CD-toksiners serumniveauer og graden af ​​CDI-sværhedsgrad/svigt ved CDI-behandling og frekvensen af ​​recidiv.
2. At evaluere kinetikken af ​​CD-toksiner i serum fra CDI-patienter, der gennemgår anti-CDI-behandling.
3. At vurdere forholdet mellem serumtoksinniveauer og længden af ​​CDI diarré.

Studere design. Prospektiv observationsundersøgelse om måling af serumniveauer af CD-toksiner hos patienter med CDI.

For at vurdere sammenhængen mellem C difficile toksiners serumniveau og sværhedsgrad og recidivrate vil 45 på hinanden følgende patienter med dokumenteret CDI-infektion blive undersøgt, heraf 20 med mild-moderat CDI, 20 med svær CDI og 5 med svær kompliceret/fulminant. CDI i henhold til ESCMID definition. For hver patient vil der blive udført tre bestemmelse af serumtoksiner på tidspunkt 0 (før påbegyndelse af anti-CDI-behandling), 4d, 10d.

Patienterne vil blive fulgt op til tre måneder efter bedring fra den første episode.

Serumtoksinernes niveauer vil være korreleret til sværhedsgraden og til det første tilbagefald.

Metodik

1. Serumprøver Perifert blod vil blive indhentet fra hver rask og CDI forsøgsperson. Serum vil blive adskilt fra den perifere blodprøve ved centrifugering ved 700 g i 5 minutter og derefter opbevaret ved -20°C indtil måling.
2. Serum-IgG-depletering Det er blevet rapporteret, at neutraliserende antistoffer til stede i humant serum, for det meste IgG, er i stand til at maskere niveauerne af C. difficile-toksiner i serum. Total IgG i serumprøver vil blive fjernet med Protein A-perler (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). To milliliter human serumprøve påføres et lige så stort volumen af ​​protein A-perler resuspenderet i bindingsbuffer og inkuberet ved stuetemperatur under roterende omrøring i 1 time. IgG bundet til Protein A-perlerne vil blive fjernet ved centrifugering. Den korrekte IgG-depletering vil blive evalueret ved western blot.
3. SDS-PAGE og western blot IgG-oprensede sera vil blive opløst med 10 % SDS-PAGE og overføres til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Efter blokering i 1 time ved stuetemperatur (RT) med 5 % fedtfri tørmælk (w/v) og 0,5 % Tween-20 (v/v) opløst i PBS, vil membranerne blive probet med anti-humant IgG primært antistof (anti-humant IgG, y-kædespecifikt antistof; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ved 4°C natten over. Membraner vil derefter blive inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med det HRP-konjugerede sekundære antistof (Bio-Rad). Proteiner vil blive visualiseret af det forbedrede kemiluminescens (ECL) detektionssystem (Bio-Rad), og billeder vil blive erhvervet ved hjælp af Chemidoc System (Bio-Rad).
4. Dot-blot

d1. Standardreference Dot-blot-tilstanden opsætning til evaluering af C. difficile TcdA- og TcdB-niveauer i humane serumprøver udføres som følger. Rekombinant TcdA og TcdB (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) vil blive opløst i deioniseret vand for at opnå 0,2 mg/ml stamopløsninger. Toksiner vil blive seriefortyndet fra 0,001 pg til 1000 pg i PBS ved pH 7,4. Ti mikroliter fortyndet TcdA og TcdB vil blive blottet i tre eksemplarer i EMD Millipore MultiScreen™ 96-brønds assayplader (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Efter 10 minutters tørring nedsænkes membranen i 2% BSA-PBS (w/v) buffer i 1 time ved 37 °C. Membranen vaskes med PBS indeholdende 0,05% Tween 20 ved pH 7,2) i 2 minutter og nedsænkes i anti-C. difficile TcdA og anti-C.difficile TcdB (Abcam) primære antistoffer (genkender de native proteiner), i 1 time ved stuetemperatur. Den korrekte fortynding af anti-TcdA- og -TcdB-antistofferne vil blive testet i henhold til producentens instruktioner. Membranen vil derefter blive vasket i 2 minutter, og prikkerne svarende til de stigende koncentrationer af TcdA og TcdB vil blive visualiseret af ECL og erhvervet af Chemidoc-systemet. Intensiteterne af de farvede blots vil blive betragtet som en standardreference for at evaluere den minimale koncentration af TcdA og TcdB, der kan påvises ved denne metode.

d2. Opsætning af volumen og fortynding af humant serum, der skal anvendes. Metodens følsomhed vil blive vurderet ved hjælp af toksæmi-negative spiked humane serumprøver, frisk fremstillet ved tilsætning af rekombinante toksiner (positiv kontrol). Mængden af ​​rekombinant TcdA og TcdB, der skal tilsættes til det tilsatte serum, vil blive valgt på basis af resultater opnået i det foregående afsnit (d1). Dette vil gøre det muligt at bestemme: (i) den minimale koncentration af TcdA og TcdB, der kan påvises ved dot-blot-metoden, når den fortyndes i det humane serum; og (ii) den korrekte volumen og fortynding af det humane serum, der skal tilsættes til hver brønd på MultiScreen™ 96-brønds assaypladerne.

d3. Dot-blot på serumprøverne fra CDI-patienter for at bestemme toksinniveauer. Humane sera afledt fra CDI-patienter vil blive IgG-depleteret (se afsnit b) og derefter plettet tre gange i MultiScreen™ 96-brønds assaypladerne. Dot-blot-metoden beskrevet i afsnit d1 vil blive anvendt til at bestemme og semi-kvantificere TcdA- og TcdB-niveauer ved hjælp af TcdA- og TcdB-standardkurverne.