Suhde C. Difficile -toksiinien seerumitason ja C. Difficile -infektion välillä

Tausta. C. difficile aiheuttaa usein toksemiaa, mutta olemassa olevien diagnostisten työkalujen rajoitetun herkkyyden vuoksi sitä ei havaita yleisessä kliinisessä käytännössä. Vaikka Clostridium difficile -infektion (CDI) aiheuttamaa toksemiaa ei havaitakaan, sitä koetaan usein, ja tämä selittää hengenvaarallisten CDI-tapausten systeemiset komplikaatiot. Viime aikoihin asti, vaikka patogeneettinen prosessi oli jo tiedossa, C. difficile -toksiinien aiheuttamaa suolenulkoista vauriota on aliarvostettu. Äskettäinen tutkimus on kuitenkin osoittanut toxemian ihmisillä. Viimeisten viiden vuoden aikana eläinkokeet ovat osoittaneet C. difficile -toksiinien esiintymisen useissa kehon nesteissä, toksemia, joka korreloi systeemisen sairauden ja kuolleisuuden kanssa. Vaikka toksiini A (TcdA) ja B (TcdB) ovat ensisijaiset virulenssitekijät, jotka ovat vastuussa C. difficileen liittyvästä ripulista ja tulehduksesta, ihmisillä on toistaiseksi raportoitu vain kolme toksemiapositiivista tapausta (kaksi aikuista ja yksi lapsi). Selitys niin pienelle toksemiapositiivisten tapausten määrälle voi olla herkän toksiinien havaitsemismenetelmän puute.

Tavoitteet.

1. Arvioida CD-toksiinien seerumitasojen ja CDI:n vaikeusasteen/CDI-hoidon epäonnistumisen ja uusiutumisnopeuden välistä yhteyttä.
2. Arvioida CD-toksiinien kinetiikkaa CDI-potilaiden seerumissa, jotka saavat anti-CDI-hoitoa.
3. Arvioida seerumin toksiinitasojen ja CDI-ripulin pituuden välistä suhdetta.

Opintojen suunnittelu. Prospektiivinen havaintotutkimus CD-toksiinien seerumipitoisuuksien mittaamisesta potilailla, joilla on CDI.

C difficile -toksiinien seerumitason ja vakavuuden ja uusiutumisasteen välisen suhteen arvioimiseksi tutkitaan 45 peräkkäistä potilasta, joilla on dokumentoitu CDI-infektio, joista 20:llä on lievä tai keskivaikea CDI, 20:llä vaikea CDI ja 5:llä vaikea komplisoitunut/fulminantti. CDI ESCMID-määritelmän mukaan. Kullekin potilaalle suoritetaan kolme seerumin toksiinien määritystä ajanhetkellä 0 (ennen anti-CDI-hoidon aloittamista), 4d, 10d.

Potilaita seurataan kolmen kuukauden ajan ensimmäisestä jaksosta toipumisen jälkeen.

Seerumin toksiinipitoisuudet korreloivat vaikeusasteen ja ensimmäisen uusiutumisen kanssa.

Metodologia

1. Seeruminäytteet Perifeeristä verta otetaan jokaiselta terveeltä ja CDI-potilaalta. Seerumi erotetaan ääreisverinäytteestä sentrifugoimalla 700 g:ssä 5 minuutin ajan ja säilytetään sitten -20 °C:ssa mittaukseen asti.
2. Seerumin IgG:n ehtyminen On raportoitu, että ihmisen seerumissa olevat neutraloivat vasta-aineet, enimmäkseen IgG, pystyvät peittämään seerumin C. difficile -toksiinipitoisuudet. Seeruminäytteiden kokonais-IgG poistetaan Protein A -helmillä (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Kaksi millilitraa ihmisen seeruminäytettä levitetään yhtä suureen tilavuuteen proteiini A -helmiä, jotka on suspendoitu uudelleen sitoutumispuskuriin, ja inkuboidaan huoneenlämpötilassa pyörivässä sekoituksessa 1 tunnin ajan. Proteiini A -helmiin sitoutunut IgG poistetaan sentrifugoimalla. Oikea IgG-depletoituminen arvioidaan Western blot -menetelmällä.
3. SDS-PAGE ja Western blot IgG-puhdistetut seerumit erotetaan 10 % SDS-PAGE:lla ja siirretään PVDF-kalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Sen jälkeen, kun kalvot on blokattu 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT) 5-prosenttisella rasvattomalla kuivamaidolla (paino/tilavuus) ja 0,5-prosenttisella Tween-20:llä (tilavuus/tilavuus) liuotettuna PBS:ään, kalvot tutkitaan primaarisella anti-ihmisen IgG-vasta-aineella. (anti-ihmisen IgG, y-ketjuspesifinen vasta-aine; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4 °C:ssa yön yli. Sitten kalvoja inkuboidaan 1 tunti huoneenlämpötilassa HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Bio-Rad) kanssa. Proteiinit visualisoidaan tehostetulla kemiluminesenssin (ECL) tunnistusjärjestelmällä (Bio-Rad) ja kuvat otetaan käyttämällä Chemidoc System -järjestelmää (Bio-Rad).
4. Piste-blot

d1. Standardiviite Dot-blot-olosuhteiden määritys ihmisen seeruminäytteiden C. difficilen TcdA- ja TcdB-tasojen arvioimiseksi suoritetaan seuraavasti. Yhdistelmä-TcdA ja TcdB (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) liuotetaan deionisoituun veteen, jotta saadaan 0,2 mg/ml kantaliuoksia. Toksiinit laimennetaan sarjassa 0,001 pg:sta 1 000 pg:aan PBS:ssä pH:ssa 7,4. Kymmenen mikrolitraa laimennettua TcdA:ta ja TcdB:tä blotataan kolmena rinnakkaisena EMD Millipore MultiScreen™ 96-kuoppa-analyysilevyille (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 10 minuutin kuivauksen jälkeen kalvo upotetaan 2 % BSA-PBS (w/v) puskuriin 1 tunniksi 37 °C:ssa. Kalvo pestään PBS:llä, joka sisältää 0,05 % Tween 20, pH 7,2) 2 minuutin ajan ja upotetaan anti-C:hen. difficile TcdA ja anti-C. difficile TcdB (Abcam) primaariset vasta-aineet (jotka tunnistavat alkuperäiset proteiinit), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Anti-TcdA- ja -TcdB-vasta-aineiden oikea laimennos testataan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kalvoa pestään sitten 2 minuutin ajan ja TcdA:n ja TcdB:n kasvavia pitoisuuksia vastaavat pisteet visualisoidaan ECL:llä ja hankitaan Chemidoc-järjestelmällä. Värillisten blottien intensiteettejä pidetään vakiovertailuna arvioitaessa TcdA:n ja TcdB:n vähimmäispitoisuutta, joka voidaan havaita tällä menetelmällä.

d2. Käytettävän ihmisseerumin tilavuuden ja laimennoksen asetukset Menetelmän herkkyys arvioidaan käyttämällä toksemianegatiivisia ihmisen seeruminäytteitä, joihin on lisätty yhdistelmä-DNA-teknisiä toksiineja (positiivinen kontrolli). Rekombinantti-TcdA:n ja TcdB:n määrä, joka lisätään piikkiseerumiin, valitaan edellisessä osiossa (d1) saatujen tulosten perusteella. Tämä mahdollistaa seuraavien määrittämisen: (i) TcdA:n ja TcdB:n pienin pitoisuus, joka voidaan havaita dot-blot-menetelmällä, kun se on laimennettu ihmisen seerumiin; ja (ii) 96-kuoppaisten MultiScreen™-määrityslevyjen kuhunkin kuoppaan lisättävän ihmisseerumin oikea tilavuus ja laimennos.

d3. Dot blot CDI-potilaiden seeruminäytteisiin toksiinitasojen määrittämiseksi Ihmisseerumit, jotka on johdettu CDI-potilaista, poistetaan IgG:stä (katso kohta b) ja täplitetään sitten 96-kuoppaisille MultiScreen™-määrityslevyille. Kohdassa d1 kuvattua dot-blot-menetelmää sovelletaan TcdA- ja TcdB-tasojen määrittämiseen ja puolikvantifiointiin käyttämällä TcdA- ja TcdB-standardikäyriä.