C. Difficile 독소의 혈청 농도와 C. Difficile 감염과의 관계

배경. C. difficile은 종종 독소혈증을 유발하지만 기존 진단 도구의 민감도 제한으로 인해 일반적인 임상에서 발견되지 않습니다. 비록 발견되지는 않았지만 클로스트리디움 디피실 감염(CDI) 유발 독소혈증이 종종 발생하며 이는 생명을 위협하는 CDI 사례의 전신 합병증을 설명합니다. 최근까지 병원성 과정은 이미 알려져 있었지만 C. difficile 독소에 의한 장외 손상 현상은 과소 평가되었습니다. 그러나 최근 연구에서 인간의 독소혈증이 입증되었습니다. 지난 5년 동안 동물 연구를 통해 여러 체액에 C. difficile 독소의 존재, 전신 질환 및 사망률과 관련된 독소혈증이 있음이 입증되었습니다. 그러나 독소 A(TcdA)와 B(TcdB)가 C. difficile 관련 설사와 염증을 일으키는 일차적인 독성 인자임에도 불구하고 지금까지 사람에게서 독성 양성 사례가 3건(성인 2명과 어린이 1명) 보고되었습니다. 이렇게 적은 수의 독소혈증 양성 사례에 대한 설명은 민감한 독소 검출 방법이 부족하기 때문일 수 있습니다.

목표.

1. CD 독소의 혈청 수준과 CDI 중증도 등급/CDI 치료 실패 및 재발률 간의 연관성을 평가합니다.
2. 항-CDI 치료를 받고 있는 CDI 환자의 혈청에서 CD 독소의 동역학을 평가하기 위함.
3. 혈청 독소 수준과 CDI 설사 기간 사이의 관계를 평가합니다.

연구 디자인. CDI 환자에서 CD 독소의 혈청 수준 측정에 대한 전향적 관찰 연구.

C 디피실레 독소의 혈청 수준과 중증도 및 재발률 사이의 관계를 평가하기 위해 CDI 감염이 기록된 45명의 연속 환자(경증-중등도 CDI 20명, 중증 CDI 20명, 중증 합병증/전격성 5명)를 대상으로 연구할 예정입니다. ESCMID 정의에 따른 CDI. 각 환자에 대해 세 가지 혈청 독소 측정이 시간 0(항-CDI 치료 시작 전), 4d, 10d에 수행됩니다.

환자는 첫 번째 에피소드에서 회복된 후 최대 3개월 동안 추적 관찰됩니다.

혈청 독소의 수준은 중증도 및 첫 번째 재발과 상관 관계가 있습니다.

방법론

1. 혈청 샘플 말초 혈액은 각각의 건강한 및 CDI 피험자로부터 얻을 것입니다. 혈청은 700g에서 5분 동안 원심분리하여 말초 혈액 샘플에서 분리한 다음 측정할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
2. 혈청 IgG 고갈 인간 혈청에 존재하는 중화 항체(주로 IgG)는 혈청 내 C. 디피실 독소 수준을 가릴 수 있다고 보고되었습니다. 혈청 샘플의 총 IgG는 Protein A 비드(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 제거됩니다. 2밀리리터의 인간 혈청 샘플을 결합 완충액에 재현탁된 동량의 단백질 A 비드에 적용하고 회전 교반 하에 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 단백질 A 비드에 결합된 IgG는 원심분리에 의해 제거됩니다. 적절한 IgG 고갈은 웨스턴 블롯에 의해 평가될 것입니다.
3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 IgG-정제된 혈청은 10% SDS-PAGE에 의해 분해되고 PVDF 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 옮겨질 것입니다. PBS에 용해된 5% 무지방 분유(w/v) 및 0.5% Tween-20(v/v)으로 실온(RT)에서 1시간 동안 차단한 후, 막을 항인간 IgG 1차 항체로 조사합니다. (anti-Human IgG, γ-chain specific antibody; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 4°C에서 밤새. 그런 다음 멤브레인을 HRP 접합 이차 항체(Bio-Rad)와 함께 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 단백질은 향상된 화학발광(ECL) 검출 시스템(Bio-Rad)에 의해 시각화되고 이미지는 Chemidoc System(Bio-Rad)을 사용하여 획득됩니다.
4. 도트 블롯

d1. 표준 참조 인간 혈청 샘플에서 C. difficile TcdA 및 TcdB 수준의 평가를 위한 도트-블롯 조건 설정은 다음과 같이 수행됩니다. 재조합 TcdA 및 TcdB(Enzo Life Science, Farmingdale, NY)는 탈이온수에 용해되어 0.2 mg/mL 저장 용액을 얻습니다. 독소는 pH 7.4의 PBS에서 0.001pg에서 1000pg로 연속 희석됩니다. 10 마이크로리터의 희석된 TcdA 및 TcdB를 EMD Millipore MultiScreen™ 96-웰 분석 플레이트(Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 3중으로 블롯팅합니다. 10분 동안 건조시킨 후 멤브레인을 37°C에서 1시간 동안 2% BSA-PBS(w/v) 버퍼에 담급니다. 막을 0.05% Tween 20을 함유한 PBS(pH 7.2)로 2분 동안 세척하고 항-C에 담근다. difficile TcdA 및 항-C.difficile RT에서 1시간 동안 TcdB(Abcam) 1차 항체(천연 단백질 인식). 제조업체의 지침에 따라 항-TcdA 및 -TcdB 항체의 적절한 희석을 테스트합니다. 그런 다음 멤브레인을 2분 동안 세척하고 TcdA 및 TcdB의 증가하는 농도에 해당하는 점을 ECL로 시각화하고 Chemidoc 시스템으로 획득합니다. 컬러 얼룩의 강도는 이 방법으로 검출할 수 있는 TcdA 및 TcdB의 최소 농도를 평가하기 위한 표준 참조로 간주됩니다.

d2. 사용할 인간 혈청의 부피 및 희석 설정 방법의 민감도는 재조합 독소를 추가하여 갓 준비한 독소혈증 음성 아군 인간 혈청 샘플(양성 대조군)을 사용하여 평가됩니다. 첨가된 혈청에 추가될 재조합 TcdA 및 TcdB의 양은 이전 섹션(d1)에서 얻은 결과를 기준으로 선택됩니다. 이렇게 하면 다음을 결정할 수 있습니다. 및 (ii) MultiScreen™ 96-웰 분석 플레이트의 각 웰에 추가할 인간 혈청의 적절한 부피 및 희석.

d3. 독소 수준을 결정하기 위한 CDI 환자의 혈청 샘플에 대한 도트 블롯 CDI 환자로부터 유래된 인간 혈청은 IgG가 고갈된 후(섹션 b 참조) MultiScreen™ 96-웰 분석 플레이트에 세 번 점적됩니다. 섹션 d1에 설명된 도트 블롯 방법은 TcdA 및 TcdB 표준 곡선을 사용하여 TcdA 및 TcdB 수준을 결정하고 반 정량화하는 데 적용됩니다.