Związek między poziomem toksyn C. Difficile w surowicy a zakażeniem C. Difficile

Tło. C. difficile często wywołuje toksemię, jednak ze względu na ograniczoną czułość istniejących narzędzi diagnostycznych pozostaje niewykrywalna w powszechnej praktyce klinicznej. Chociaż niewykryta toksemia wywołana zakażeniem Clostridium difficile (CDI) jest często doświadczana, co wyjaśnia ogólnoustrojowe powikłania zagrażających życiu przypadków CDI. Do niedawna, choć proces patogenetyczny był już znany, zjawisko uszkodzeń pozajelitowych powodowanych przez toksyny C. difficile było niedoceniane. Jednak ostatnie badania wykazały toksemię u ludzi. W ciągu ostatnich 5 lat badania na zwierzętach wykazały obecność toksyn C. difficile w kilku płynach ustrojowych, zatrucie korelujące z chorobą ogólnoustrojową i śmiertelnością. Jednakże, chociaż toksyna A (TcdA) i B (TcdB) są głównymi czynnikami wirulencji odpowiedzialnymi za biegunkę i stany zapalne związane z C. difficile, dotychczas odnotowano u ludzi tylko trzy przypadki pozytywnego wyniku toksemii (dwie osoby dorosłe i jedno dziecko). Wyjaśnieniem tak małej liczby przypadków toksemii dodatnich może być brak czułej metody wykrywania toksyn.

Cele.

1. Ocena związku między poziomami toksyn CDI w surowicy a stopniem nasilenia CDI/nieskuteczności leczenia CDI i częstością nawrotów.
2. Ocena kinetyki toksyn CD w surowicy pacjentów z CDI poddawanych leczeniu anty-CDI.
3. Ocena związku między stężeniem toksyn w surowicy a długością biegunki CDI.

Projekt badania. Prospektywne badanie obserwacyjne dotyczące pomiaru poziomu toksyn CD w surowicy u pacjentów z CDI.

W celu oceny zależności między poziomem toksyn C. difficile w surowicy a ciężkością i częstością nawrotów przebadanych zostanie 45 kolejnych pacjentów z udokumentowanym zakażeniem CDI, w tym 20 z łagodnym i umiarkowanym CDI, 20 z ciężkim CDI i 5 z ciężkim powikłanym/ piorunującym CDI zgodnie z definicją ESCMID. Dla każdego pacjenta zostaną wykonane trzy oznaczenia toksyn w surowicy w czasie 0 (przed rozpoczęciem leczenia anty-CDI), 4d, 10d.

Pacjenci będą obserwowani przez okres do trzech miesięcy po wyzdrowieniu z pierwszego epizodu.

Poziomy toksyn w surowicy będą skorelowane z ciężkością i pierwszym nawrotem.

Metodologia

1. Próbki surowicy Krew obwodowa zostanie pobrana od każdego zdrowego pacjenta i osoby z CDI. Surowica zostanie oddzielona od próbki krwi obwodowej przez wirowanie przy 700 g przez 5 min, a następnie przechowywana w temperaturze -20°C do czasu pomiaru.
2. Zmniejszenie stężenia IgG w surowicy Istnieją doniesienia, że ​​przeciwciała neutralizujące obecne w surowicy ludzkiej, głównie IgG, są w stanie maskować poziomy toksyn C. difficile w surowicy. Całkowite IgG w próbkach surowicy zostanie usunięte za pomocą perełek białka A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Dwa mililitry próbki ludzkiej surowicy zostaną nałożone na równą objętość kulek białka A ponownie zawieszonych w buforze wiążącym i inkubowane w temperaturze pokojowej z mieszaniem obrotowym przez 1 godzinę. IgG związane z kulkami Białka A zostaną usunięte przez odwirowanie. Właściwy spadek poziomu IgG zostanie oceniony metodą Western blot.
3. Surowice oczyszczone przez SDS-PAGE i western blot IgG zostaną rozdzielone przez 10% SDS-PAGE i przeniesione na membrany PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Po blokowaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) z 5% odtłuszczonym mlekiem w proszku (wag./obj.) i 0,5% Tween-20 (obj./obj.) rozpuszczonym w PBS, membrany będą sondowane pierwszorzędowym przeciwciałem anty-ludzkim IgG (anty-ludzka IgG, przeciwciało specyficzne dla łańcucha γ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), w 4°C przez noc. Błony będą następnie inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z HRP (Bio-Rad). Białka będą wizualizowane za pomocą systemu detekcji wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (Bio-Rad), a obrazy będą pozyskiwane za pomocą systemu Chemidoc (Bio-Rad).
4. Dot-blot

d1. Standardowe odniesienia Warunki dot-blot do oceny poziomów TcdA i TcdB C. difficile w próbkach ludzkiej surowicy zostaną przeprowadzone w następujący sposób. Rekombinowane TcdA i TcdB (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) zostaną rozpuszczone w wodzie dejonizowanej w celu uzyskania roztworów podstawowych o stężeniu 0,2 mg/ml. Toksyny będą seryjnie rozcieńczane od 0,001 pg do 1000 pg w PBS o pH 7,4. Dziesięć mikrolitrów rozcieńczonych TcdA i TcdB zostanie przeniesionych w trzech powtórzeniach na 96-studzienkowe płytki testowe EMD Millipore MultiScreen™ (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Po 10 minutach suszenia membranę zanurza się w buforze 2% BSA-PBS (wag./obj.) na 1 godzinę w temperaturze 37°C. Membranę przemywa się PBS zawierającym 0,05% Tween 20, przy pH 7,2) przez 2 min i zanurza w anty-C. difficile TcdA i anty-Cdifficile Pierwotne przeciwciała TcdB (Abcam) (rozpoznające białka natywne), przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zbadane zostanie właściwe rozcieńczenie przeciwciał anty-TcdA i -TcdB, zgodnie z zaleceniami producenta. Membrana będzie następnie płukana przez 2 minuty, a kropki odpowiadające rosnącym stężeniom TcdA i TcdB będą wizualizowane przez ECL i rejestrowane przez system Chemidoc. Intensywność barwnych kleksów będzie traktowana jako standardowe odniesienie do oceny minimalnego stężenia TcdA i TcdB, które można wykryć tą metodą.

d2. Ustawienie objętości i rozcieńczenia stosowanej surowicy ludzkiej Czułość metody zostanie oceniona przy użyciu wzbogaconych próbek surowicy ludzkiej z ujemnym wynikiem toksemii, świeżo przygotowanych przez dodanie rekombinowanych toksyn (kontrola pozytywna). Ilość rekombinowanych TcdA i TcdB, które mają być dodane do wzbogaconej surowicy, zostanie wybrana na podstawie wyników uzyskanych w poprzedniej sekcji (d1). Pozwoli to na określenie: (i) minimalnego stężenia TcdA i TcdB, które można wykryć metodą dot-blot po rozcieńczeniu w surowicy ludzkiej; oraz (ii) odpowiednią objętość i rozcieńczenie ludzkiej surowicy, które mają być dodane do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki testowej MultiScreen™.

d3. Dot blot na próbkach surowicy pacjentów z CDI w celu określenia poziomów toksyn Ludzkie surowice pochodzące od pacjentów z CDI zostaną pozbawione IgG (patrz część b), a następnie naniesione trzykrotnie na 96-studzienkowe płytki testowe MultiScreen™. Metoda dot-blot opisana w sekcji d1 zostanie zastosowana do określenia i półilościowego określenia poziomów TcdA i TcdB przy użyciu standardowych krzywych TcdA i TcdB.