Relazione tra il livello sierico delle tossine di C. Difficile e l'infezione da C. Difficile

Sfondo. C. difficile induce frequentemente tossiemia, tuttavia, a causa della sensibilità limitata degli strumenti diagnostici esistenti, non viene rilevato nella comune pratica clinica. Anche se non rilevata, la tossiemia indotta da infezione da Clostridium difficile (CDI) è spesso sperimentata, e questo spiega le complicanze sistemiche dei casi di CDI potenzialmente letali. Fino a poco tempo fa, sebbene il processo patogenetico fosse già noto, il fenomeno del danno extraintestinale causato dalle tossine di C. difficile è stato sottovalutato. Tuttavia, uno studio recente ha dimostrato la tossiemia negli esseri umani. Negli ultimi 5 anni, studi sugli animali hanno dimostrato la presenza di tossine di C. difficile in diversi fluidi corporei, tossiemia correlata a malattie sistemiche e mortalità. Tuttavia, sebbene la tossina A (TcdA) e B (TcdB) siano i principali fattori di virulenza responsabili della diarrea e dell'infiammazione associate a C. difficile, finora nell'uomo sono stati segnalati solo tre casi positivi alla tossiemia (due adulti e un bambino). La spiegazione di un numero così basso di casi positivi alla tossiemia potrebbe essere la mancanza di un metodo di rilevamento delle tossine sensibili.

Obiettivi.

1. Per valutare l'associazione tra i livelli sierici delle tossine CD e il grado di gravità / fallimento del trattamento CDI e il tasso di recidiva di CDI.
2. Per valutare la cinetica delle tossine CD nel siero di pazienti CDI sottoposti a trattamento anti-CDI.
3. Per valutare la relazione tra i livelli di tossine sieriche e la durata della diarrea CDI.

Progettazione dello studio. Studio osservazionale prospettico sulla misurazione dei livelli sierici di tossine CD in pazienti con CDI.

Al fine di valutare la relazione tra il livello sierico delle tossine di C difficile e la gravità e il tasso di recidiva, verranno studiati 45 pazienti consecutivi con infezione documentata da CDI, di cui 20 con CDI lieve-moderata, 20 con CDI grave e 5 con CDI grave complicata/fulminante CDI secondo la definizione ESCMID. Per ogni paziente verranno eseguite tre determinazioni delle tossine sieriche al tempo 0 (prima dell'inizio del trattamento anti-CDI), 4d, 10d.

I pazienti saranno seguiti fino a tre mesi dopo il recupero dal primo episodio.

I livelli di tossine sieriche saranno correlati alla gravità e alla prima recidiva.

Metodologia

1. Campioni di siero Il sangue periferico sarà prelevato da entrambi i soggetti sani e CDI. Il siero sarà separato dal campione di sangue periferico mediante centrifugazione a 700 g per 5 min, e poi conservato a -20°C fino alla misurazione.
2. Deplezione delle IgG sieriche È stato riportato che gli anticorpi neutralizzanti presenti nel siero umano, principalmente IgG, sono in grado di mascherare i livelli di tossine di C. difficile nel siero. Le IgG totali nei campioni di siero saranno rimosse con perle di Proteina A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Due millilitri di campione di siero umano saranno applicati a un volume uguale di sferette di proteina A risospese in tampone legante e incubate a temperatura ambiente sotto agitazione rotativa per 1 ora. Le IgG legate ai granuli di Proteina A saranno rimosse mediante centrifugazione. La corretta deplezione di IgG sarà valutata mediante western blot.
3. I sieri purificati con SDS-PAGE e western blot IgG saranno risolti al 10% con SDS-PAGE e trasferiti su membrane PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Dopo il blocco per 1 ora a temperatura ambiente (RT) con il 5% di latte scremato in polvere (p/v) e lo 0,5% di Tween-20 (v/v) disciolti in PBS, le membrane saranno sondate con anticorpo primario anti-IgG umane (anti-IgG umana, anticorpo specifico per la catena γ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), a 4°C durante la notte. Le membrane saranno quindi incubate per 1 ora a temperatura ambiente con l'anticorpo secondario coniugato con HRP (Bio-Rad). Le proteine ​​saranno visualizzate mediante il sistema di rilevamento a chemiluminescenza (ECL) potenziato (Bio-Rad) e le immagini saranno acquisite utilizzando il sistema Chemidoc (Bio-Rad).
4. Macchia di punti

d1. Riferimento standard L'impostazione della condizione dot-blot per la valutazione dei livelli di C. difficile TcdA e TcdB nei campioni di siero umano sarà eseguita come segue. TcdA e TcdB ricombinanti (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) saranno sciolti in acqua deionizzata per ottenere soluzioni madre di 0.2 mg/mL. Le tossine saranno diluite in serie da 0.001 pg a 1000 pg in PBS a pH 7.4. Dieci microlitri di TcdA e TcdB diluiti saranno macchiati in triplicato in EMD Millipore MultiScreen™ 96-Well Assay Plates (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Dopo 10 min di asciugatura, la membrana verrà immersa in tampone BSA-PBS (p/v) al 2% per 1 h a 37 °C. La membrana sarà lavata con PBS contenente 0.05% Tween 20, a pH 7.2) per 2 min e immersa in anti-C. difficile TcdA e anti-C.difficile Anticorpi primari TcdB (Abcam) (che riconoscono le proteine ​​native), per 1 ora a temperatura ambiente. Verrà testata la corretta diluizione degli anticorpi anti-TcdA e -TcdB, secondo le istruzioni del produttore. La membrana verrà quindi lavata per 2 min ei punti corrispondenti alle concentrazioni crescenti di TcdA e TcdB saranno visualizzati dall'ECL e acquisiti dal sistema Chemidoc. Le intensità delle macchie colorate saranno considerate come standard di riferimento per valutare la concentrazione minima di TcdA e TcdB rilevabile con questo metodo.

d2. Impostazione del volume e della diluizione del siero umano da utilizzare La sensibilità del metodo sarà valutata utilizzando campioni di siero umano tossiemia-negativi addizionati di fresco preparati con l'aggiunta di tossine ricombinanti (controllo positivo). La quantità di TcdA e TcdB ricombinanti da aggiungere al siero addizionato sarà scelta sulla base dei risultati ottenuti nella sezione precedente (d1). Ciò consentirà di determinare: (i) la concentrazione minima di TcdA e TcdB rilevabile con il metodo dot-blot quando diluiti nel siero umano; e (ii) il volume e la diluizione appropriati del siero umano da aggiungere a ciascun pozzetto delle piastre per test MultiScreen™ a 96 pozzetti.

d3. Dot blot sui campioni di siero di pazienti con CDI per determinare i livelli di tossine I sieri umani derivati ​​da pazienti con CDI saranno depleti di IgG (vedere la sezione b) e quindi individuati tre volte nelle piastre di analisi MultiScreen™ a 96 pozzetti. Il metodo dot-blot descritto nella sezione d1 verrà applicato per determinare e semi-quantificare i livelli di TcdA e TcdB, utilizzando le curve standard di TcdA e TcdB.