Relatie tussen het serumniveau van C. Difficile-toxinen en C. Difficile-infectie

Achtergrond. C. difficile veroorzaakt vaak toxemie, maar vanwege de beperkte gevoeligheid van bestaande diagnostische hulpmiddelen wordt het in de gangbare klinische praktijk niet opgemerkt. Hoewel onopgemerkt, wordt door Clostridium difficile-infectie (CDI) geïnduceerde toxemie vaak ervaren, en dit verklaart de systemische complicaties van levensbedreigende CDI-gevallen. Hoewel het pathogenetische proces al bekend was, werd tot voor kort het fenomeen van extra-intestinale schade veroorzaakt door C. difficile-toxines ondergewaardeerd. Een recente studie heeft echter toxemie bij mensen aangetoond. In de afgelopen 5 jaar hebben dierstudies de aanwezigheid van C. difficile-toxinen in verschillende lichaamsvloeistoffen aangetoond, waarbij toxemie correleert met systemische ziekte en mortaliteit. Hoewel toxine A (TcdA) en B (TcdB) de primaire virulentiefactoren zijn die verantwoordelijk zijn voor C. difficile-geassocieerde diarree en ontsteking, zijn tot nu toe slechts drie toxemia-positieve gevallen (twee volwassenen en één kind) bij mensen gemeld. De verklaring voor zo'n laag aantal toxemia-positieve gevallen kan het ontbreken van een gevoelige toxinedetectiemethode zijn.

Doelstellingen.

1. Om het verband te beoordelen tussen de serumspiegels van CD-toxinen en de graad van CDI-ernst/mislukking van CDI-behandeling en recidiefpercentage.
2. Om de kinetiek van CD-toxines in het serum van CDI-patiënten die een anti-CDI-behandeling ondergaan te evalueren.
3. Om de relatie tussen serumtoxineniveaus en duur van CDI-diarree te beoordelen.

Studie ontwerp. Prospectief observationeel onderzoek naar de meting van serumspiegels van CD-toxines bij patiënten met CDI.

Om de relatie tussen het serumgehalte van C difficile-toxinen en de ernst en het recidiefpercentage te beoordelen, zullen 45 opeenvolgende patiënten met gedocumenteerde CDI-infectie worden bestudeerd, waaronder 20 met milde tot matige CDI, 20 met ernstige CDI en 5 met ernstige gecompliceerde/fulminante CDI volgens ESCMID-definitie. Voor elke patiënt zullen drie bepalingen van serumtoxinen worden uitgevoerd op tijdstip 0 (vóór aanvang van anti-CDI-behandeling), 4d, 10d.

Patiënten worden gevolgd tot drie maanden na het herstel van de eerste episode.

De niveaus van de serumtoxinen zullen worden gecorreleerd aan de ernst en aan de eerste herhaling.

Methodologie

1. Serummonsters Perifeer bloed zal worden verkregen van elke gezonde en CDI-proefpersoon. Serum wordt gescheiden van het perifere bloedmonster door middel van centrifugatie bij 700 g gedurende 5 minuten, en vervolgens bewaard bij -20°C tot meting.
2. IgG-depletie in serum Er is gerapporteerd dat neutraliserende antilichamen die aanwezig zijn in menselijk serum, voornamelijk IgG, in staat zijn de niveaus van C. difficile-toxinen in serum te maskeren. Totaal IgG in serummonsters zal worden verwijderd met Proteïne A-kralen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS). Twee milliliter menselijk serummonster zal worden aangebracht op een gelijk volume eiwit-A-korrels, opnieuw gesuspendeerd in bindingsbuffer, en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder roterend roeren worden geïncubeerd. Het aan de Proteïne A-parels gebonden IgG zal worden verwijderd door centrifugeren. De juiste IgG-depletie zal worden beoordeeld met Western-blot.
3. SDS-PAGE en western blot IgG-gezuiverde sera zullen worden gescheiden met 10% SDS-PAGE en overgebracht op PVDF-membranen (Bio-Rad, Hercules, CA, VS). Na blokkering gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (KT) met 5% magere droge melk (w/v) en 0,5% Tween-20 (v/v) opgelost in PBS, zullen de membranen worden onderzocht met primair anti-humaan IgG-antilichaam (anti-humaan IgG, y-keten-specifiek antilichaam; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS), bij 4°C overnacht. Membranen zullen vervolgens gedurende 1 uur bij kamertemperatuur worden geïncubeerd met het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam (Bio-Rad). Eiwitten zullen worden gevisualiseerd door het verbeterde chemiluminescentie (ECL) detectiesysteem (Bio-Rad) en beelden zullen worden verkregen met behulp van het Chemidoc-systeem (Bio-Rad).
4. Dot-blot

d1. Standaardreferentie De opstelling van de dot-blot-conditie voor de evaluatie van C. difficile TcdA- en TcdB-niveaus in de menselijke serummonsters zal als volgt worden uitgevoerd. Recombinant TcdA en TcdB (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) zullen worden opgelost in gedeïoniseerd water om stockoplossingen van 0,2 mg/ml te verkrijgen. Toxines worden serieel verdund van 0,001 pg tot 1000 pg in PBS bij pH 7,4. Tien microliter verdunde TcdA en TcdB zullen in drievoud worden geblot in EMD Millipore MultiScreen™ 96-well assayplaten (Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). Na 10 minuten drogen wordt het membraan ondergedompeld in 2% BSA-PBS (w/v) buffer gedurende 1 uur bij 37 °C. Het membraan wordt gewassen met PBS dat 0,05% Tween 20 bevat, bij pH 7,2) gedurende 2 minuten en ondergedompeld in anti-C. difficile TcdA en anti-C.difficile TcdB (Abcam) primaire antilichamen (herkennen van de natieve eiwitten), gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De juiste verdunning van de anti-TcdA- en -TcdB-antilichamen wordt getest volgens de instructies van de fabrikant. Het membraan wordt vervolgens gedurende 2 minuten gewassen en de stippen die overeenkomen met de toenemende concentraties van TcdA en TcdB worden gevisualiseerd door ECL en verkregen door het Chemidoc-systeem. De intensiteiten van de gekleurde vlekken zullen worden beschouwd als een standaardreferentie om de minimale concentratie van TcdA en TcdB te evalueren die met deze methode kan worden gedetecteerd.

d2. Opstelling van het volume en de verdunning van het te gebruiken menselijk serum De gevoeligheid van de methode zal worden beoordeeld met toxemie-negatieve verrijkte monsters van menselijk serum die vers zijn bereid door toevoeging van recombinante toxines (positieve controle). De hoeveelheid recombinant TcdA en TcdB die aan het verrijkte serum moet worden toegevoegd, wordt gekozen op basis van de resultaten verkregen in de vorige sectie (d1). Dit maakt het mogelijk om te bepalen: (i) de minimale concentratie van TcdA en TcdB die kan worden gedetecteerd met de dot-blot-methode wanneer deze wordt verdund in het menselijk serum; en (ii) het juiste volume en de juiste verdunning van het menselijke serum dat moet worden toegevoegd aan elk putje van de MultiScreen™-assayplaten met 96 putjes.

d3. Dot-blot op de serummonsters van CDI-patiënten om toxineniveaus te bepalen. Menselijke sera afkomstig van CDI-patiënten zullen IgG-gedepleteerd worden (zie sectie b) en vervolgens driemaal in de MultiScreen™-assayplaten met 96 putjes worden gespot. De dot-blot-methode beschreven in sectie d1 zal worden toegepast om TcdA- en TcdB-niveaus te bepalen en semi-kwantificeren, met behulp van de TcdA- en TcdB-standaardcurven.