Relation entre le niveau sérique des toxines C. Difficile et l'infection à C. Difficile

Arrière-plan. C. difficile induit fréquemment une toxémie, mais en raison de la sensibilité limitée des outils de diagnostic existants, il n'est pas détecté dans la pratique clinique courante. Bien que non détectée, la toxémie induite par l'infection à Clostridium difficile (ICD) est souvent ressentie, ce qui explique les complications systémiques des cas d'ICD mettant la vie en danger. Jusqu'à récemment, bien que le processus pathogénique soit déjà connu, le phénomène des lésions extra-intestinales causées par les toxines de C. difficile était sous-évalué. Cependant, une étude récente a prouvé la toxémie chez l'homme. Au cours des 5 dernières années, des études animales ont prouvé la présence de toxines C. difficile dans plusieurs fluides corporels, une toxémie corrélée à une maladie systémique et à la mortalité. Cependant, bien que les toxines A (TcdA) et B (TcdB) soient les principaux facteurs de virulence responsables de la diarrhée et de l'inflammation associées à C. difficile, seuls trois cas positifs à la toxémie (deux adultes et un enfant) ont été signalés jusqu'à présent chez l'homme. L'explication d'un si faible nombre de cas positifs pour la toxémie peut être le manque de méthode de détection des toxines sensibles.

Objectifs.

1. Évaluer l'association entre les taux sériques de toxines CD et le degré de gravité/échec du traitement de l'ICD et le taux de récidive.
2. Évaluer la cinétique des toxines CD dans le sérum de patients ICD subissant un traitement anti-ICD.
3. Évaluer la relation entre les niveaux de toxines sériques et la durée de la diarrhée ICD.

Étudier le design. Étude observationnelle prospective sur la mesure des taux sériques de toxines CD chez les patients atteints d'ICD.

Afin d'évaluer la relation entre le taux sérique de toxines C difficile et la gravité et le taux de récidive, 45 patients consécutifs avec une infection documentée à l'ICD seront étudiés, dont 20 avec une ICD légère à modérée, 20 avec une ICD sévère et 5 avec une infection grave compliquée/fulminante. CDI selon la définition ESCMID. Pour chaque patient trois déterminations des toxines sériques seront réalisées au temps 0 (avant initiation du traitement anti-CDI), 4j, 10j.

Les patients seront suivis jusqu'à trois mois après la guérison du premier épisode.

Les taux de toxines sériques seront corrélés à la gravité et à la première récidive.

Méthodologie

1. Échantillons de sérum Le sang périphérique sera obtenu à partir de chacun des sujets sains et CDI. Le sérum sera séparé de l'échantillon de sang périphérique par centrifugation à 700 g pendant 5 min, puis conservé à -20°C jusqu'à la mesure.
2. Déplétion des IgG sériques Il a été rapporté que les anticorps neutralisants présents dans le sérum humain, principalement des IgG, sont capables de masquer les niveaux de toxines C. difficile dans le sérum. Les IgG totales dans les échantillons de sérum seront éliminées avec des billes de protéine A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Deux millilitres d'échantillon de sérum humain seront appliqués à un volume égal de billes de protéine A remises en suspension dans un tampon de liaison et incubés à température ambiante sous agitation rotative pendant 1 h. L'IgG liée aux billes de protéine A sera éliminée par centrifugation. La déplétion appropriée d'IgG sera évaluée par western blot.
3. Les sérums purifiés par SDS-PAGE et western blot IgG seront résolus par 10% SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Après blocage pendant 1 h à température ambiante (TA) avec 5 % de lait écrémé en poudre (p/v) et 0,5 % de Tween-20 (v/v) dissous dans du PBS, les membranes seront sondées avec un anticorps primaire anti-IgG humaine (anti-Human IgG, anticorps spécifique de la chaîne γ ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), à 4°C pendant une nuit. Les membranes seront ensuite incubées pendant 1 h à TA avec l'anticorps secondaire conjugué à la HRP (Bio-Rad). Les protéines seront visualisées par le système de détection par chimiluminescence améliorée (ECL) (Bio-Rad) et les images seront acquises à l'aide du système Chemidoc (Bio-Rad).
4. Dot-blot

d1. Référence standard La configuration de la condition de transfert en point pour l'évaluation des niveaux de TcdA et de TcdB de C. difficile dans les échantillons de sérum humain sera effectuée comme suit. Le TcdA et le TcdB recombinants (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) seront dissous dans de l'eau déminéralisée pour obtenir des solutions mères à 0,2 mg/mL. Les toxines seront diluées en série de 0,001 pg à 1000 pg dans du PBS à pH 7,4. Dix microlitres de TcdA et de TcdB dilués seront transférés en trois exemplaires dans des plaques de dosage à 96 puits EMD Millipore MultiScreen™ (Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Après 10 min de séchage, la membrane sera immergée dans un tampon 2% BSA-PBS (w/v) pendant 1 h à 37 °C. La membrane sera lavée avec du PBS contenant 0,05% de Tween 20, à pH 7,2) pendant 2 min et immergée dans de l'anti-C. difficile TcdA et anti-C.difficile Anticorps primaires TcdB (Abcam) (reconnaissant les protéines natives), pendant 1 h à TA. La bonne dilution des anticorps anti-TcdA et -TcdB sera testée, selon les instructions du fabricant. La membrane sera ensuite lavée pendant 2 min et les points correspondant aux concentrations croissantes de TcdA et TcdB seront visualisés par ECL et acquis par le système Chemidoc. Les intensités des taches colorées seront considérées comme une référence standard pour évaluer la concentration minimale de TcdA et TcdB pouvant être détectée par cette méthode.

d2. Mise en place du volume et de la dilution de sérum humain à utiliser La sensibilité de la méthode sera évaluée à l'aide d'échantillons de sérum humain dopés toxémiques négatifs fraîchement préparés par ajout de toxines recombinantes (témoin positif). La quantité de TcdA et TcdB recombinants à ajouter au sérum dopé sera choisie sur la base des résultats obtenus dans la section précédente (d1). Cela permettra de déterminer : (i) la concentration minimale de TcdA et TcdB qui peut être détectée par la méthode dot-blot lorsqu'elle est diluée dans le sérum humain ; et (ii) le volume et la dilution appropriés du sérum humain à ajouter à chaque puits des plaques de dosage à 96 puits MultiScreen™.

d3. Dot blot sur les échantillons de sérum de patients CDI pour déterminer les niveaux de toxines Les sérums humains dérivés de patients CDI seront appauvris en IgG (voir section b) puis déposés trois fois dans les plaques de dosage MultiScreen™ à 96 puits. La méthode dot-blot décrite dans la section d1 sera appliquée pour déterminer et semi-quantifier les niveaux de TcdA et TcdB, en utilisant les courbes standard TcdA et TcdB.