Beziehung zwischen dem Serumspiegel von C. Difficile-Toxinen und einer C. Difficile-Infektion

Hintergrund. C. difficile induziert häufig Toxämie, bleibt jedoch aufgrund der begrenzten Empfindlichkeit bestehender diagnostischer Instrumente in der üblichen klinischen Praxis unentdeckt. Obwohl unentdeckt, kommt es häufig zu einer durch eine Clostridium-difficile-Infektion (CDI) induzierten Toxämie, was die systemischen Komplikationen lebensbedrohlicher CDI-Fälle erklärt. Obwohl der pathogenetische Prozess bereits bekannt war, wurde bis vor kurzem das Phänomen der extraintestinalen Schädigung durch C. difficile-Toxine unterschätzt. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat jedoch eine Toxämie beim Menschen nachgewiesen. In den letzten 5 Jahren haben Tierversuche das Vorhandensein von C. difficile-Toxinen in mehreren Körperflüssigkeiten nachgewiesen, wobei Toxämie mit systemischer Erkrankung und Mortalität korreliert. Obwohl Toxin A (TcdA) und B (TcdB) die primären Virulenzfaktoren sind, die für C. difficile-assoziierte Durchfälle und Entzündungen verantwortlich sind, wurden bisher nur drei Toxämie-positive Fälle (zwei Erwachsene und ein Kind) beim Menschen gemeldet. Die Erklärung für eine so geringe Zahl von Toxämie-positiven Fällen könnte das Fehlen einer empfindlichen Toxin-Nachweismethode sein.

Ziele.

1. Bewertung des Zusammenhangs zwischen den Serumspiegeln von CD-Toxinen und dem Schweregrad der CDI/dem Versagen der CDI-Behandlung und der Rezidivrate.
2. Bewertung der Kinetik von CD-Toxinen im Serum von CDI-Patienten, die sich einer Anti-CDI-Behandlung unterziehen.
3. Um die Beziehung zwischen Serumtoxinspiegeln und der Dauer von CDI-Durchfall zu beurteilen.

Studiendesign. Prospektive Beobachtungsstudie zur Messung des Serumspiegels von CD-Toxinen bei Patienten mit CDI.

Um die Beziehung zwischen dem Serumspiegel von C. difficile-Toxinen und dem Schweregrad und der Rezidivrate zu beurteilen, werden 45 aufeinanderfolgende Patienten mit dokumentierter CDI-Infektion untersucht, darunter 20 mit leichter bis mittelschwerer CDI, 20 mit schwerer CDI und 5 mit schwerer komplizierter/fulminanter CDI gemäß ESCMID-Definition. Für jeden Patienten werden zum Zeitpunkt 0 (vor Beginn der Anti-CDI-Behandlung), 4d, 10d, drei Bestimmungen von Serumtoxinen durchgeführt.

Die Patienten werden bis zu drei Monate nach der Genesung von der ersten Episode nachbeobachtet.

Die Serumtoxinwerte werden mit dem Schweregrad und dem ersten Rezidiv korreliert.

Methodik

1. Serumproben Peripheres Blut wird von allen gesunden und CDI-Probanden erhalten. Das Serum wird von der peripheren Blutprobe durch 5-minütige Zentrifugation bei 700 g getrennt und dann bis zur Messung bei -20 °C gelagert.
2. Serum-IgG-Verarmung Es wurde berichtet, dass im menschlichen Serum vorhandene neutralisierende Antikörper, hauptsächlich IgG, in der Lage sind, die Toxinspiegel von C. difficile im Serum zu maskieren. Gesamt-IgG in Serumproben wird mit Protein-A-Kügelchen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) entfernt. Zwei Milliliter Humanserumprobe werden auf ein gleiches Volumen von Protein-A-Kügelchen aufgetragen, die in Bindungspuffer resuspendiert sind, und bei Raumtemperatur unter Rotationsbewegung für 1 Stunde inkubiert. Das an die Protein A-Kügelchen gebundene IgG wird durch Zentrifugation entfernt. Die ordnungsgemäße IgG-Depletion wird durch Western Blot bewertet.
3. SDS-PAGE- und Western-Blot-IgG-gereinigte Seren werden durch 10 % SDS-PAGE aufgelöst und auf PVDF-Membranen (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) übertragen. Nach 1-stündigem Blockieren bei Raumtemperatur (RT) mit 5 % fettfreier Trockenmilch (w/v) und 0,5 % Tween-20 (v/v), gelöst in PBS, werden die Membranen mit primärem Anti-Human-IgG-Antikörper sondiert (Anti-Human-IgG, γ-Ketten-spezifischer Antikörper; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), bei 4°C über Nacht. Die Membranen werden dann für 1 h bei RT mit dem HRP-konjugierten sekundären Antikörper (Bio-Rad) inkubiert. Proteine ​​werden durch das Enhanced Chemiluminescence (ECL)-Detektionssystem (Bio-Rad) sichtbar gemacht und Bilder werden mit dem Chemidoc-System (Bio-Rad) erfasst.
4. Punktfleck

d1. Standardreferenz Der Aufbau der Dot-Blot-Bedingungen für die Bewertung der TcdA- und TcdB-Spiegel von C. difficile in Humanserumproben wird wie folgt durchgeführt. Rekombinantes TcdA und TcdB (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) werden in entionisiertem Wasser gelöst, um 0,2 mg/ml Stammlösungen zu erhalten. Toxine werden seriell von 0,001 pg bis 1000 pg in PBS bei pH 7,4 verdünnt. Zehn Mikroliter verdünntes TcdA und TcdB werden dreifach auf EMD Millipore MultiScreen™ 96-Well-Assayplatten (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) geblottet. Nach 10-minütigem Trocknen wird die Membran 1 h lang bei 37 °C in 2 % BSA-PBS-Puffer (w/v) eingetaucht. Die Membran wird mit PBS, enthaltend 0,05 % Tween 20, bei pH 7,2, 2 Minuten lang gewaschen und in Anti-C getaucht. difficile TcdA und Anti-C.difficile TcdB (Abcam) Primärantikörper (die die nativen Proteine ​​erkennen), für 1 h bei RT. Die richtige Verdünnung der Anti-TcdA- und -TcdB-Antikörper wird gemäß den Anweisungen des Herstellers getestet. Die Membran wird dann 2 Minuten lang gewaschen und die Punkte, die den steigenden Konzentrationen von TcdA und TcdB entsprechen, werden von ECL visualisiert und vom Chemidoc-System erfasst. Die Intensitäten der farbigen Blots werden als Standardreferenz angesehen, um die minimale Konzentration von TcdA und TcdB zu bewerten, die mit dieser Methode nachgewiesen werden kann.

d2. Ansetzen des zu verwendenden Volumens und der Verdünnung des Humanserums Die Sensitivität des Verfahrens wird anhand von Toxämie-negativen dotierten Humanserumproben bestimmt, die durch Zugabe von rekombinanten Toxinen frisch hergestellt werden (Positivkontrolle). Die Menge an rekombinantem TcdA und TcdB, die dem dotierten Serum zugesetzt werden soll, wird auf der Grundlage der im vorherigen Abschnitt (d1) erhaltenen Ergebnisse ausgewählt. Dies ermöglicht die Bestimmung: (i) der minimalen Konzentration von TcdA und TcdB, die durch das Dot-Blot-Verfahren nachgewiesen werden kann, wenn es in Humanserum verdünnt wird; und (ii) das richtige Volumen und die richtige Verdünnung des Humanserums, das in jede Vertiefung der MultiScreen™ 96-Well-Testplatten gegeben wird.

d3. Dot-Blot auf den Serumproben von CDI-Patienten zur Bestimmung des Toxinspiegels Humanseren von CDI-Patienten werden IgG-abgereichert (siehe Abschnitt b) und dann dreimal in die MultiScreen™ 96-Well-Testplatten getüpfelt. Das in Abschnitt d1 beschriebene Dot-Blot-Verfahren wird angewendet, um die TcdA- und TcdB-Spiegel unter Verwendung der TcdA- und TcdB-Standardkurven zu bestimmen und halb zu quantifizieren.