Vztah mezi sérovou hladinou toxinů C. Difficile a infekcí C. Difficile

Pozadí. C. difficile často vyvolává toxémii, avšak vzhledem k omezené citlivosti stávajících diagnostických nástrojů zůstává v běžné klinické praxi neodhalena. I když není zjištěna, často se vyskytuje toxémie vyvolaná infekcí Clostridium difficile (CDI), což vysvětluje systémové komplikace život ohrožujících případů CDI. Donedávna, ačkoli byl patogenetický proces již znám, fenomén extraintestinálního poškození způsobeného toxiny C. difficile byl podceňován. Nedávná studie však prokázala toxémii u lidí. V posledních 5 letech studie na zvířatech prokázaly přítomnost toxinů C. difficile v několika tělesných tekutinách, toxémii korelující se systémovým onemocněním a mortalitou. Ačkoli jsou však toxin A (TcdA) a B (TcdB) primárními virulentními faktory odpovědnými za průjem a zánět spojený s C. difficile, u lidí byly dosud hlášeny pouze tři případy pozitivní na toxémii (dva dospělí a jedno dítě). Vysvětlením tak nízkého počtu případů pozitivních na toxémii může být nedostatek citlivých metod detekce toxinů.

Cíle.

1. Posoudit souvislost mezi sérovými hladinami CD toxinů a stupněm závažnosti CDI/selhání léčby CDI a mírou recidivy.
2. Vyhodnotit kinetiku CD toxinů v séru pacientů s CDI podstupujících léčbu anti-CDI.
3. Posoudit vztah mezi hladinami sérových toxinů a délkou průjmu CDI.

Studovat design. Prospektivní observační studie o měření sérových hladin CD toxinů u pacientů s CDI.

Za účelem posouzení vztahu mezi sérovou hladinou toxinů C. difficile a závažností a mírou recidivy bude studováno 45 po sobě jdoucích pacientů s dokumentovanou infekcí CDI, včetně 20 s mírnou až středně těžkou CDI, 20 s těžkou CDI a 5 s těžkou komplikovanou/fulminantní CDI podle definice ESCMID. U každého pacienta budou provedena tři stanovení sérových toxinů v čase 0 (před zahájením léčby anti-CDI), 4d, 10d.

Pacienti budou sledováni až tři měsíce po zotavení z první epizody.

Hladiny sérových toxinů budou korelovat se závažností a první recidivou.

Metodologie

1. Vzorky séra Od každého zdravého a CDI subjektu bude odebrána periferní krev. Sérum se oddělí od vzorku periferní krve centrifugací při 700 g po dobu 5 minut a poté se skladuje při -20 °C až do měření.
2. Deplece IgG v séru Bylo hlášeno, že neutralizační protilátky přítomné v lidském séru, většinou IgG, jsou schopny maskovat hladiny toxinů C. difficile v séru. Celkový IgG ve vzorcích séra bude odstraněn kuličkami Protein A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Dva mililitry vzorku lidského séra budou aplikovány na stejný objem kuliček proteinu A resuspendovaných ve vazebném pufru a inkubovány při teplotě místnosti za rotačního míchání po dobu 1 hodiny. IgG navázaný na kuličky Proteinu A bude odstraněn centrifugací. Správná deplece IgG bude hodnocena pomocí Western blotu.
3. SDS-PAGE a western blot IgG-čištěná séra budou rozdělena pomocí 10% SDS-PAGE a přenesena na PVDF membrány (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Po blokování po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě (RT) 5% odtučněným sušeným mlékem (w/v) a 0,5% Tween-20 (v/v) rozpuštěným v PBS, budou membrány sondovány primární protilátkou proti lidskému IgG (anti-Human IgG, specifická protilátka pro y-řetězec; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), při 4 °C přes noc. Membrány budou poté inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s HRP-konjugovanou sekundární protilátkou (Bio-Rad). Proteiny budou vizualizovány vylepšeným chemiluminiscenčním (ECL) detekčním systémem (Bio-Rad) a snímky budou pořízeny pomocí systému Chemidoc (Bio-Rad).
4. Dot-blot

d1. Standardní reference Nastavení dot-blot podmínek pro hodnocení hladin TcdA a TcdB C. difficile ve vzorcích lidského séra bude provedeno následovně. Rekombinantní TcdA a TcdB (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) se rozpustí v deionizované vodě, aby se získaly zásobní roztoky o koncentraci 0,2 mg/ml. Toxiny budou sériově ředěny od 0,001 pg do 1000 pg v PBS při pH 7,4. Deset mikrolitrů zředěného TcdA a TcdB bude blotováno v triplikátech do EMD Millipore MultiScreen™ 96-jamkových testovacích destiček (Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Po 10 minutách sušení bude membrána ponořena do 2% BSA-PBS (w/v) pufru na 1 hodinu při 37 °C. Membrána se promyje PBS obsahujícím 0,05 % Tween 20, při pH 7,2) po dobu 2 minut a ponoří se do anti-C. difficile TcdA a anti-C.difficile Primární protilátky TcdB (Abcam) (rozpoznávající nativní proteiny) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Správné ředění protilátek anti-TcdA a -TcdB bude testováno podle pokynů výrobce. Membrána bude poté promývána po dobu 2 minut a tečky odpovídající zvyšujícím se koncentracím TcdA a TcdB budou vizualizovány pomocí ECL a získány systémem Chemidoc. Intenzity barevných skvrn budou považovány za standardní referenci pro vyhodnocení minimální koncentrace TcdA a TcdB, kterou lze touto metodou detekovat.

d2. Nastavení objemu a ředění lidského séra, které má být použito Citlivost metody bude hodnocena pomocí vzorků lidského séra s negativním příměsí, čerstvě připravených přidáním rekombinantních toxinů (pozitivní kontrola). Množství rekombinantního TcdA a TcdB, které se má přidat do obohaceného séra, bude zvoleno na základě výsledků získaných v předchozí části (d1). To umožní stanovení: (i) minimální koncentrace TcdA a TcdB, která může být detekována metodou dot-blot, když je zředěna v lidském séru; a (ii) správný objem a ředění lidského séra, které má být přidáno do každé jamky 96-jamkové testovací destičky MultiScreen™.

d3. Dot blot na vzorcích séra pacientů s CDI pro stanovení hladin toxinů Lidská séra získaná od pacientů s CDI budou zbavena IgG (viz část b) a poté nanesena do testovacích destiček MultiScreen™ s 96 jamkami. Pro stanovení a semikvantifikaci hladin TcdA a TcdB bude použita metoda dot-blot popsaná v sekci d1 pomocí standardních křivek TcdA a TcdB.