Relação entre o nível sérico das toxinas de C. difficile com a infecção por C. difficile

Fundo. C. difficile freqüentemente induz toxemia, no entanto, devido à sensibilidade limitada das ferramentas de diagnóstico existentes, não é detectado na prática clínica comum. Embora não detectada, a toxemia induzida por infecção por Clostridium difficile (CDI) é frequentemente experimentada, e isso explica as complicações sistêmicas dos casos de CDI com risco de vida. Até recentemente, embora o processo patogenético já fosse conhecido, o fenômeno do dano extraintestinal causado pelas toxinas do C. difficile era subestimado. No entanto, um estudo recente comprovou a toxemia em humanos. Nos últimos 5 anos, estudos em animais comprovaram a presença de toxinas de C. difficile em vários fluidos corporais, correlacionando a toxemia com doenças sistêmicas e mortalidade. No entanto, embora as toxinas A (TcdA) e B (TcdB) sejam os principais fatores de virulência responsáveis ​​pela diarreia e inflamação associadas a C. difficile, apenas três casos positivos de toxemia (dois adultos e uma criança) foram relatados até agora em humanos. A explicação para um número tão baixo de casos positivos para toxemia pode ser a falta de método de detecção de toxinas sensíveis.

Objetivos.

1. Avaliar a associação entre os níveis séricos das toxinas da CD e o grau de gravidade/falha no tratamento da CDI e a taxa de recorrência.
2. Avaliar a cinética das toxinas CD no soro de pacientes com CDI em tratamento anti-CDI.
3. Avaliar a relação entre os níveis de toxinas séricas e a duração da diarreia CDI.

Design de estudo. Estudo observacional prospectivo sobre a medição dos níveis séricos de toxinas CD em pacientes com CDI.

A fim de avaliar a relação entre o nível sérico das toxinas C difficile e a gravidade e a taxa de recorrência, serão estudados 45 pacientes consecutivos com infecção por ICD documentada, incluindo 20 com ICD leve a moderada, 20 com ICD grave e 5 com ICD grave complicada/fulminante CDI de acordo com a definição ESCMID. Para cada paciente serão realizadas três determinações de toxinas séricas no tempo 0 (antes do início do tratamento anti-CDI), 4d, 10d.

Os pacientes serão acompanhados até três meses após a recuperação do primeiro episódio.

Os níveis de toxinas séricas serão correlacionados com a gravidade e com a primeira recidiva.

Metodologia

1. Amostras de soro Sangue periférico será obtido de cada indivíduo saudável e CDI. O soro será separado da amostra de sangue periférico por centrifugação a 700 g por 5 min, e então armazenado a -20°C até a medição.
2. Depleção sérica de IgG Foi relatado que os anticorpos neutralizantes presentes no soro humano, principalmente IgG, são capazes de mascarar os níveis de toxinas C. difficile no soro. A IgG total nas amostras de soro será removida com grânulos de Proteína A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). Dois mililitros de amostra de soro humano serão aplicados a igual volume de grânulos de proteína A ressuspensos em tampão de ligação e incubados à temperatura ambiente sob agitação rotativa por 1 h. A IgG ligada aos grânulos de Proteína A será removida por centrifugação. A depleção adequada de IgG será avaliada por western blot.
3. Os soros purificados por SDS-PAGE e western blot IgG serão separados por SDS-PAGE a 10% e transferidos para membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Após o bloqueio por 1 h à temperatura ambiente (RT) com 5% de leite em pó desnatado (p/v) e 0,5% Tween-20 (v/v) dissolvido em PBS, as membranas serão sondadas com anticorpo primário anti-IgG humano (anti-Human IgG, anticorpo específico da cadeia y; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), a 4°C durante a noite. As membranas serão então incubadas por 1 h em temperatura ambiente com o anticorpo secundário conjugado com HRP (Bio-Rad). As proteínas serão visualizadas pelo sistema de detecção de quimioluminescência aprimorada (ECL) (Bio-Rad) e as imagens serão adquiridas usando o sistema Chemidoc (Bio-Rad).
4. mancha

d1. Referência padrão A configuração da condição dot-blot para a avaliação dos níveis de C. difficile TcdA e TcdB nas amostras de soro humano será realizada da seguinte forma. TcdA e TcdB recombinantes (Enzo Life Science, Farmingdale, NY) serão dissolvidos em água deionizada para obter soluções estoque de 0,2 mg/mL. As toxinas serão diluídas em série de 0,001 pg a 1000 pg em PBS a pH 7,4. Dez microlitros de TcdA e TcdB diluídos serão transferidos em triplicado para EMD Millipore MultiScreen™ 96-Well Assay Plates (Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Após 10 min de secagem, a membrana será imersa em tampão BSA-PBS 2% (p/v) por 1 h a 37 °C. A membrana será lavada com PBS contendo Tween 20 0,05%, pH 7,2) por 2 min e imersa em anti-C. difficile TcdA e anti-C. difficile Anticorpos primários TcdB (Abcam) (reconhecendo as proteínas nativas), por 1 h à temperatura ambiente. Será testada a diluição adequada dos anticorpos anti-TcdA e -TcdB, conforme instruções do fabricante. A membrana será então lavada por 2 min e os pontos correspondentes às concentrações crescentes de TcdA e TcdB serão visualizados por ECL e adquiridos pelo sistema Chemidoc. As intensidades dos blots coloridos serão consideradas como referência padrão para avaliar a concentração mínima de TcdA e TcdB que pode ser detectada por este método.

d2. Determinação do volume e diluição do soro humano a ser usado A sensibilidade do método será avaliada usando amostras de soro humano adicionado de toxemia negativo, recém-preparado pela adição de toxinas recombinantes (controle positivo). A quantidade de TcdA e TcdB recombinantes a serem adicionados ao soro enriquecido será escolhida com base nos resultados obtidos na seção anterior (d1). Isso permitirá determinar: (i) a concentração mínima de TcdA e TcdB que pode ser detectada pelo método dot-blot quando diluída no soro humano; e (ii) o volume e a diluição adequados do soro humano a serem adicionados a cada poço das placas de ensaio de 96 poços MultiScreen™.

d3. Dot blot nas amostras de soro de pacientes com CDI para determinar os níveis de toxinas Os soros humanos derivados de pacientes com CDI serão depletados de IgG (consulte a seção b) e então colocados rapidamente nas placas de ensaio de 96 poços MultiScreen™. O método dot-blot descrito na seção d1 será aplicado para determinar e semi-quantificar os níveis de TcdA e TcdB, usando as curvas padrão de TcdA e TcdB.