エピジェネティクス、ビタミン C、および異常な血球形成 - 低リスクの骨髄性悪性腫瘍患者におけるビタミン C (EVITA)

背景 最近の調査では、エピジェネティック制御因子の変異が、見かけ上正常な高齢者の造血と骨髄性癌患者 (pts) の両方で一般的であることが示されています。 DNA メチル化は永久的なサイレンシング マークであると長い間予想されていましたが、10 11 転座 (TET) 酵素の発見により、活発な脱メチル化が起こることが明らかになりました。 このプロセスの最初のステップは TET 酵素によって触媒されますが、血液がんでは頻繁に変異およびメチル化されます。 ヒストンの脱メチル化を触媒する十文字酵素も、血液がんにおいて異常に制御されています。

ビタミン C (VitC) は、壊血病の予防に必要な微量栄養素として 1930 年代に特定されました。 植物やほとんどの動物とは異なり、人間は必要な酵素である L-グロノラクトンオキシダーゼが不足しているため、グルコースから vitC を合成することができません。 したがって、ビタミンCは食事から摂取する必要があります。 最近の研究では、vitC が Fe(II)-および 2-オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼ ファミリーの重要な補因子であることが認識されています。 これらには、5-メチルシトシン (5-mC) からその酸化誘導体 5-ヒドロキシメチルシトシン (5-hmC)、5-カルボキシル シトシン (5-caC)、および 5-ホルミルシトシン (5-ホルミルシトシン) への変換に関与する TET 酵素が含まれます。 -fC)、およびヒストンの脱メチル化に関与する十文字酵素。 したがって、vitC は DNA およびヒストン脱メチル化の調節において重要な役割を果たす可能性があります。 しかし、血液がん患者の 80 パーセント以上が、深刻な vitC 欠乏症であることがわかりました。 興味深いことに、研究者らが最近実施したランダム化プラセボ対照パイロット研究 (NCT02877277) に含まれる 20 人の参加者の分析は、アザシチジンによる治療を受けている MDS および CMML 患者の vitC レベルが、経口 vitC サプリメントによって容易に正常範囲に上昇することを示しています。 (未発表データ)。 すでに vitC サプリメントを摂取していた患者がプラセボに切り替えられたとき、vitC レベルは正常範囲を急速に下回りました。

5-hmC およびその誘導体の形成は、健康な個人および TET 変異を有する患者で損なわれる可能性があることも示されています。 ただし、これらの変異の多くはヘテロ接合性であり、3 つの TET 酵素 (TET1、TET2、および TET3) にはある程度の冗長性がある可能性があるため、vitC を生理学的レベルに回復させると、5-hmC/5-mC のレベルに影響を与える可能性があります。 TET 変異クローン造血または血液がんの個人。

パイロット研究の参加者から得た末梢血 (PB) 単核細胞 (MNC) の 5-hmC/5-mC レベルの分析でも、vitC アームで 5-hmC が増加する明確な傾向が示されましたが、試験を設計した後、研究者は、5-hmC/5-mC レベルが 10 ～ 20 倍高い骨髄 (BM) の造血幹細胞でより適切に測定されることを認識しました。 したがって、パイロット研究は、低リスクの骨髄性悪性腫瘍患者における経口 vitC の無作為化プラセボ対照試験でフォローアップされます。すなわち、CCUS または低リスク MDS/CMML であり、経口 vitC がこれらの疾患の実体の生物学を変化させ、最終的に進行を防ぐことができるかどうかを調査します。

仮説:

1. 研究者と共同研究者は以前に、癌患者は vitC 欠乏症であり、MDS の前を表す CCUS を持つ個人も vitC 欠乏症である可能性があることを示しました。 仮説は、これにより、がん患者とCCUS患者の両方でin vivoで5-hmC/5-mCのレベルが低下する可能性があるというものです。

2. vitC の経口補給により、CCUS および低リスク MDS/CMML 患者の血清 vitC レベルを正常範囲に上昇させることができます。

   • 悪性クローンを減らし、
   • 5-hmC/5-mC 比を増やし、
   • 血漿サイトカインプロファイルを、炎症性が低く、腫瘍形成性の低いプロファイルに変更します。
   • 遺伝子発現を変える

目的:

CCUS および低リスクの MDS/CMML ポイントで vitC を正常範囲に戻すことができるかどうかを判断するには:

1. 悪性クローンを減らし、
2. CCUS および低リスク MDS/CMML 患者の 5-hmC/5-mC 比を増加させる
3. プロモーター/エンハンサー/長末端反復配列 (LTR)、または腫瘍抑制因子/メチル化ドライバー遺伝子/造血発達に関与する遺伝子の他の調節ゲノム領域での 5-mC の蓄積を減少させ、
4. これらの遺伝子の発現をアップレギュレートし、
5. 血漿サイトカインプロファイルを変更し、
6. 腸の透過性（末梢血中の細菌DNAの濃度によって測定）および/または腸内微生物叢の組成を変化させる、
7. 安全上のリスクを伴います。

研究計画 合計 100 人の患者が登録される予定です。 2017 年 11 月から 2021 年 12 月までの間に、Rigshospitalet、Herlev University Hospital、Odense University Hospital、Aalborg University Hospital、または南カリフォルニア大学の Keck Hospital から、CCUS、低リスク MDS、または CMML-0 または -1 の患者が含まれます。

参加者は、1:1 の比率でブロックのランダム化に入ります。 vitC 1000 mg/日 p.o. 1 年間のプラセボとの比較。

健常高齢者ボランティアは最大30名の登録を予定しています。 PB 中の細菌 DNA の量と種類が決定され、コントロールとして機能します。

材料および測定 ＰＢ：ＰＢサンプル（４５ｍＬ）を試験開始時および最初の１年間は３ヶ月ごと（または医師の選択により必要な場合はそれ以上）に採取する。

測定値には、血球数、葉酸、ビタミン B12、ビタミン D、鉄、フェリチン、トランスフェリン、トランスフェリン飽和度、血漿 vitC レベル、サイトカイン、および細菌 DNA 含有量 (患者の皮膚および糞便中の細菌 DNA を参照) のレベルが含まれます。 .

BM: BM サンプル (18 mL) は、試験開始時、3 か月後、および 1 年後に採取されます。

vitC およびさまざまなサイトカインのレベルが測定されます。 エピジェネティック制御因子を含む骨髄性癌/クローン性造血に頻繁に関与する遺伝子の変異、およびバリアント対立遺伝子頻度 (VAF) は、選別された BM CD34+ 細胞 (利用可能な場合) または研究登録時に選別された CD34+ の BM 陰性画分におけるターゲット次世代シーケンシングによって調査されます。 、3ヶ月後、1年後。

BM CD34+ 造血幹細胞に対して、RNA シーケンシングと全 5-hmC/5-mC 評価を実施します。

糞便: 研究登録時、3 か月後、および 1 年後に、患者のサブセットから糞便サンプル (9 mL) を収集します。 細菌の DNA が抽出され、配列が決定されます。

研究バイオバンク 研究バイオバンクは、Rigshospitalet / Biotech Research and Innovation Center の Epi-/Genome Laboratory に設立され、参加者からの生物学的サンプルを保管します。 研究バイオバンクは、個人データの処理に関する法律に従って、地域科学倫理委員会とデンマークのデータ保護庁によって承認されています (ライセンス番号. それぞれ H-16022249 および 04864/RH-2016-259)。 BM および PB から分離された MNC を凍結保存し、顆粒球ペレットおよび血漿に加えて保存します。 研究バイオバンクの閉鎖日は 2030 年 12 月 31 日です。

相関研究のために、生物学的サンプルは、RNAシーケンシングとDNAメチル化およびヒドロキシメチル化の分析のために、米国グランドラピッズにあるヴァンアンデル研究所、および英国ロンドンにあるインペリアルカレッジ（外部協力者）に送られます。 生物学的サンプルは、コペンハーゲン大学の生命科学学部とデンマーク工科大学の国立獣医学研究所 (外部協力者) にも送られ、それぞれ血清 vitC 濃度の測定と T 細胞応答の分析が行われます。

方法 VitC 測定: アスコルビン酸および総 vitC、すなわち、アスコルビン酸 + デヒドロアスコルビン酸 (vitC の酸化型; DHA) は、電量検出を備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC) によって定量化されます。 DHA は、総 vitC からアスコルビン酸を差し引くことによって評価されます。 尿酸は内因性内部標準として使用されます。

セルソーティング: 磁気活性化セルソーティング (MACS、EasySep デバイスを使用)。

合計 5-hmC/5-mC 測定: 5-hmC のドットブロット分析。 質量分析による 5-hmC/5-mC 測定。

遺伝子座固有の 5-hmC/5-mC 測定: "EPIC" 850 K BeadChip。 選択した部位の 5-hmC/5-mC は、パイロシーケンシングによって測定されます。

遺伝子発現: 全 RNA 配列決定および逆転写酵素定量的ポリメラーゼ連鎖反応。

変異検出: 記載されているように、骨髄性癌で反復的に変異した遺伝子のパネルのターゲット次世代シーケンシング。

統計的考察と検出力の計算 この研究は、in vivo でヒトの造血幹細胞の 5-hmC/5-mC レベルに対する単剤療法としての vitC の効果を調べる最初の研究です。 したがって、検出力の計算やサンプル サイズの計算を実行することはできません。 参加者数 (n=100) は、主要エンドポイントでのグループ (vitC とプラセボ) 間の潜在的な有意差を観察するために必要な推定数として設定されます。ベースラインから12か月までの体細胞変異のVAFの変化の中央値。

有効性分析は、治療意図によるものです。 安全性分析には、少なくとも 1 回のプロトコル療法を受けるすべての参加者が含まれます。

倫理的考慮事項 この研究は、地域科学倫理委員会 (H-16022249) およびデンマーク データ保護庁 (04864/RH-2016-259) によって承認されています。

プロジェクトに含まれるすべての参加者は、口頭および書面で通知されます。 参加は、書面による同意後にのみ受け入れられます。 参加者は、医療システムでの治療に影響を与えることなく、いつでも何らかの理由で研究を取り下げることができることを通知されます。

記載されているターゲット DNA シーケンシング アプローチを使用すると、骨髄性悪性腫瘍に関連する参加者の生殖細胞変異を検出するリスクがわずかにあります。 参加者は、プロジェクト分析中に表示される可能性のある関連する健康関連情報をこれ以上受け取りたくない場合は、インフォームド コンセントに記載するよう求められます。 参加者が、研究で潜在的な健康関連のランダムな発見について知らされたくないことを明示的に述べない限り、ランダムな発見の場合、参加者は通知され、地元の病院でさらなる調査と遺伝カウンセリングが提供されます。

患者の不利な点、副作用、リスク、および合併症 採血には、短時間の不快感および/または痛みが伴います。 採血に伴う重大なリスクはありません。 局所出血が発生することがあり、まれに数日間不快感や変色を引き起こすことがあります. まれに、採血が血管迷走神経反応を引き起こし、短時間の意識喪失につながることがあります。

BM 誤嚥は、局所麻酔が与えられている間、短い痛みを伴います。 さらに、多くの人は、BM が吸引されている間、股関節と脚に不快感を覚えます。 これは約 30 秒間続きます。 最後に、処置後数日間、多少の圧痛が生じることがあります。 BM 調査を受けることで考えられる合併症には、出血や感染などがあります。 ただし、これらの合併症の発生率は非常に低いです。

Nordic Nutrition Recommendations によると、1 日あたり 1000 mg を超える vitC の摂取が発がん性または催奇形性であるという証拠はありません。 しかし、多量の摂取 (> 1000-2000 mg/日) は、下痢やその他の胃腸障害を引き起こす可能性があり、影響を受けやすい人は、シュウ酸生成の増加による腎臓結石の形成を経験する可能性があります. vitC は生理的用量でのみ投与されるため、この研究は安全であり、参加者に追加のリスクをもたらすことはないと予想されます。パイロット研究からの経験によって裏付けられた仮定。