Epigenética, Vitamina C e Formação Anormal de Células Sanguíneas - Vitamina C em Pacientes com Malignidades Mielóides de Baixo Risco (EVITA)

ANTECEDENTES Investigações recentes mostraram que mutações em reguladores epigenéticos são comuns, tanto na hematopoiese aparentemente normal de idosos quanto em pacientes (pts) com cânceres mieloides. Há muito se previa que a metilação do DNA era uma marca de silenciamento permanente, mas com a descoberta das dez onze enzimas de translocação (TET) tornou-se claro que a desmetilação ativa ocorre. As etapas iniciais desse processo são catalisadas por enzimas TET, que são, no entanto, frequentemente mutadas e metiladas em cânceres hematológicos. As enzimas Jumonji, que catalisam a desmetilação das histonas, também são reguladas de forma aberrante em cânceres hematológicos.

A vitamina C (VitC) foi identificada na década de 1930 como o micronutriente necessário na prevenção do escorbuto. Ao contrário das plantas e da maioria dos animais, os humanos são incapazes de sintetizar vitC a partir da glicose devido à falta da enzima necessária, a L-gulonolactona oxidase. Portanto, a vitC deve ser fornecida através da dieta. Estudos recentes reconhecem a vitC como um importante cofator para a família Fe(II)- e 2-oxoglutarato dioxigenase. Estes incluem as enzimas TET, que estão envolvidas na conversão de 5-metilcitosina (5-mC) em seus derivados oxidados 5-hidroximetilcitosina (5-hmC), 5-carboxilcitosina (5-caC) e 5-formilcitosina (5-hmC). -fC) e as enzimas Jumonji que estão envolvidas na desmetilação das histonas. Consequentemente, a vitC pode potencialmente desempenhar um papel importante na regulação do DNA e na desmetilação das histonas. No entanto, > 80 por cento dos pacientes com câncer hematológico foram severamente deficientes em vitC. Curiosamente, as análises de 20 participantes incluídos no estudo piloto randomizado, controlado por placebo recentemente conduzido pelos investigadores (NCT02877277) mostram que o nível de vitC em pacientes com MDS e CMML submetidos a tratamento com azacitidina é facilmente elevado para a faixa normal por suplemento oral de vitC (dados não publicados). Quando os pacientes que já estavam tomando suplementos de vitC foram trocados por placebo, os níveis de vitC caíram rapidamente abaixo da faixa normal.

Também foi demonstrado que a formação de 5-hmC e seus derivados pode estar comprometida em indivíduos saudáveis ​​e pacientes com mutações TET. No entanto, como muitas dessas mutações são heterozigóticas e como as três enzimas TET (TET1, TET2 e TET3) podem ter alguma redundância, a restauração de vitC para níveis fisiológicos pode ter um impacto no nível de 5-hmC/5-mC em indivíduos com hematopoiese clonal mutante TET ou câncer hematológico.

As análises dos níveis de 5-hmC/5-mC nas células mononucleares (MNCs) do sangue periférico (PB) dos participantes do estudo piloto também mostraram uma clara tendência de aumento de 5-hmC no braço de vitC, no entanto, após a concepção do estudo, o os investigadores perceberam que os níveis de 5-hmC/5-mC são melhor medidos em células-tronco hematopoiéticas na medula óssea (BM), onde os níveis são 10 a 20 vezes maiores. Assim, o estudo piloto será acompanhado por um estudo randomizado controlado por placebo de vitC oral em indivíduos com malignidades mieloides de baixo risco; ou seja, CCUS ou MDS/CMML de baixo risco, para investigar se a vitC oral pode alterar a biologia dessas entidades patológicas e, por fim, prevenir a progressão.

Hipóteses:

1. Os investigadores e colaboradores mostraram anteriormente que os pacientes com câncer são deficientes em vitC, e indivíduos com CCUS, que representa pré-MDS, também podem ser deficientes em vitC. A hipótese é que isso pode levar a níveis reduzidos de 5-hmC/5-mC in vivo tanto em pacientes com câncer quanto em indivíduos com CCUS

2. Elevar os níveis séricos de vitC para a faixa normal em pacientes com CCUS e pacientes com MDS/LMMC de baixo risco por meio de suplementação oral com vitC pode

   • reduzir o clone maligno,
   • aumentar a razão 5-hmC/5-mC,
   • alterar o perfil de citocinas plasmáticas para um perfil menos inflamatório e menos tumorigênico,
   • alterar expressão gênica

Mira:

Para determinar se a restauração de vitC para a faixa normal em CCUS e pts de MDS/CMML de baixo risco pode:

1. reduzir o clone maligno,
2. aumentar a relação 5-hmC/5-mC em CCUS e pts MDS/CMML de baixo risco
3. reduzir o acúmulo de 5-mC em promotores/intensificadores/repetições terminais longas (LTRs) ou em outras regiões genômicas reguladoras de supressores de tumor/genes condutores metilados/genes envolvidos no desenvolvimento hematopoiético,
4. regular positivamente a expressão desses genes,
5. alterar o perfil de citocinas plasmáticas,
6. alterar a permeabilidade intestinal (medida pela concentração de DNA bacteriano no sangue periférico) e/ou composição da microbiota intestinal,
7. implicar quaisquer riscos de segurança.

PLANO DE PESQUISA Um total de 100 pacientes está planejado para inscrição. Indivíduos com CCUS, MDS de baixo risco ou CMML-0 ou -1 serão incluídos no Rigshospitalet, Herlev University Hospital, Odense University Hospital, Aalborg University Hospital ou Keck Hospital da University of Southern California entre novembro de 2017 e dezembro de 2021.

Os participantes entrarão em randomização em bloco com proporção de 1:1; vitC 1000 mg/dia p.o. versus placebo por um ano.

Até 30 voluntários idosos saudáveis ​​estão planejados para inscrição. A quantidade e o tipo de DNA bacteriano em PB serão determinados e servirão como controles.

MATERIAL E MEDIDAS PB: Amostras de PB (45 mL) serão coletadas no início do estudo e a cada 3 meses (ou mais se necessário de acordo com a escolha do médico) durante o primeiro ano.

As medições incluem hemogramas, incluindo contagem diferencial, níveis de ácido fólico, vitamina B12, vitamina D, ferro, ferritina, transferrina, saturação de transferrina, níveis plasmáticos de vitC, citocinas e conteúdo de DNA bacteriano (referenciado ao DNA bacteriano na pele do paciente e nas fezes) .

BM: Amostras de BM (18 mL) serão coletadas no início do estudo, após 3 meses e após um ano.

Os níveis de vitC e várias citocinas serão medidos. Mutações em genes frequentemente envolvidos em câncer mielóide/hematopoiese clonal, incluindo reguladores epigenéticos e frequências alélicas variantes (VAF) serão investigadas por sequenciamento de próxima geração direcionado em células BM CD34+ classificadas (se disponíveis) ou fração negativa BM de triagem CD34+ na entrada do estudo , após 3 meses e após um ano.

O sequenciamento de RNA e avaliação total de 5-hmC/5-mC serão realizados em células-tronco hematopoiéticas BM CD34+.

Fezes: Amostras de fezes (9 mL) serão coletadas de um subconjunto de pacientes no início do estudo, após 3 meses e após um ano. O DNA bacteriano será extraído e sequenciado.

BIOBANCO DE PESQUISA Um biobanco de pesquisa será estabelecido no Laboratório de Epi-/Genome, Rigshospitalet / Centro de Pesquisa e Inovação em Biotecnologia para armazenar as amostras biológicas dos participantes. O biobanco de pesquisa é aprovado pelo Comitê Regional de Ética Científica e pela Agência Dinamarquesa de Proteção de Dados de acordo com a Lei de Processamento de Dados Pessoais (licença nº. H-16022249 e 04864/RH-2016-259, respectivamente). MNCs separadas criopreservadas de BM e PB serão armazenadas além de pellets de granulócitos e plasma. A data de encerramento do biobanco de pesquisa é 31-12-2030.

Para estudos correlativos, amostras biológicas serão enviadas ao Van Andel Research Institute, Grand Rapids, EUA, e Imperial College, Londres, Reino Unido (colaboradores externos), para sequenciamento de RNA e análises de metilação e hidroximetilação do DNA, respectivamente. Amostras biológicas também serão enviadas para a Faculdade de Ciências da Vida, Universidade de Copenhague, e Instituto Nacional de Veterinária, Universidade Técnica da Dinamarca (colaboradores externos) para medição das concentrações séricas de vitC e análises das respostas das células T, respectivamente.

MÉTODOS Medição de VitC: Ascorbato e vitC total, ou seja, ascorbato + ácido dehidroascórbico (a forma oxidada de vitC; DHA), são quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção coulométrica; O DHA é avaliado pela subtração do ascorbato da vitC total. O ácido úrico é utilizado como padrão interno endógeno.

Classificação de células: classificação de células ativadas por magnetismo (MACS, usando um dispositivo EasySep).

Medição total de 5-hmC/5-mC: análise de mancha de 5-hmC. Medição de 5-hmC/5-mC por espectrometria de massa.

Medição de 5-hmC/5-mC específica do locus: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC em locais selecionados serão medidos por pirosequenciamento.

Expressão gênica: Sequenciamento de RNA total e reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcriptase reversa.

Detecção de mutação: Sequenciamento direcionado de próxima geração de um painel de genes com mutação recorrente em câncer mieloide, conforme descrito.

CONSIDERAÇÕES ESTATÍSTICAS E CÁLCULO DE PODER Este estudo é o primeiro a examinar os efeitos da vitC como monoterapia nos níveis de 5-hmC/5-mC em células-tronco hematopoiéticas em humanos in vivo. Portanto, não é possível realizar um cálculo de poder ou um cálculo de tamanho de amostra. O número de participantes (n=100) é definido como uma estimativa do número necessário para observar uma possível diferença significativa entre os grupos (vitC vs. placebo) no endpoint primário; alteração mediana no VAF de mutações somáticas desde a linha de base até 12 meses.

As análises de eficácia são por intenção de tratar. As análises de segurança incluem todos os participantes que recebem pelo menos uma dose da terapia de protocolo.

CONSIDERAÇÕES ÉTICAS O estudo foi aprovado pelo Comitê Regional de Ética Científica (H-16022249) e pela Agência Dinamarquesa de Proteção de Dados (04864/RH-2016-259).

Todos os participantes incluídos no projeto serão informados oralmente e por escrito. A participação só será aceita após consentimento por escrito. Os participantes serão informados de que podem, a qualquer momento e por qualquer motivo, desistir do estudo sem que isso afete seu tratamento no sistema de saúde.

Usando a abordagem de sequenciamento de DNA direcionada descrita, há um pequeno risco de detectar uma mutação germinativa nos participantes relacionada à malignidade mieloide. Os participantes serão solicitados a declarar no consentimento informado se não desejam receber mais informações relevantes relacionadas à saúde que possam aparecer durante as análises do projeto. A menos que o participante declare explicitamente que não deseja ser informado sobre quaisquer possíveis achados aleatórios relacionados à saúde no estudo, o participante será informado e receberá mais investigações e aconselhamento genético no hospital local em caso de achados aleatórios.

Desvantagens do paciente, efeitos colaterais, riscos e complicações A coleta de sangue está associada a um breve desconforto e/ou dor. Não há riscos significativos associados à amostragem de sangue. Pode ocorrer sangramento local, que em casos raros pode causar desconforto e descoloração por alguns dias. Raramente, uma amostra de sangue pode causar reação vasovagal levando a uma breve perda de consciência.

A aspiração de BM está associada a uma dor breve durante a aplicação da anestesia local. Além disso, muitos indivíduos experimentam uma sensação desconfortável nas narinas e nas pernas enquanto o BM é aspirado. Isso dura aproximadamente 30 segundos. Finalmente, pode ocorrer alguma sensibilidade por alguns dias após o procedimento. Possíveis complicações para se submeter a uma investigação de MB incluem sangramento e infecção. No entanto, a incidência dessas complicações é extremamente baixa.

De acordo com as Recomendações Nórdicas de Nutrição, não há evidências de que a ingestão de vitC acima de 1.000 mg/dia seja cancerígena ou teratogênica. No entanto, altas ingestões (> 1.000-2.000 mg/dia) podem causar diarréia e outros distúrbios gastrointestinais e indivíduos suscetíveis podem apresentar formação de cálculos renais devido ao aumento da formação de oxalato. Como a vitC é administrada apenas em doses fisiológicas, espera-se que o estudo seja seguro e não ofereça riscos adicionais aos participantes; uma suposição que é apoiada pela experiência do estudo piloto.