Epigenetyka, witamina C i nieprawidłowe tworzenie się krwinek - witamina C u pacjentów z nowotworami szpikowymi niskiego ryzyka (EVITA)

Tło Ostatnie badania wykazały, że mutacje w regulatorach epigenetycznych są powszechne, zarówno w pozornie prawidłowej hematopoezie osób starszych, jak iu pacjentów (pacjentów) z rakiem mieloidalnym. Od dawna oczekiwano, że metylacja DNA będzie trwałym znakiem wyciszenia, ale wraz z odkryciem dziesięciu jedenastu enzymów translokacyjnych (TET) stało się jasne, że zachodzi aktywna demetylacja. Początkowe etapy tego procesu są katalizowane przez enzymy TET, które jednak często ulegają mutacjom i metylacji w nowotworach hematologicznych. Enzymy Jumonji, które katalizują demetylację histonów, są również nieprawidłowo regulowane w nowotworach hematologicznych.

Witamina C (VitC) została zidentyfikowana w latach 30-tych jako niezbędny mikroelement w zapobieganiu szkorbutowi. W przeciwieństwie do roślin i większości zwierząt, ludzie nie są w stanie syntetyzować witaminy C z glukozy z powodu braku wymaganego enzymu, oksydazy L-gulonolaktonowej. Dlatego witC musi być dostarczana z pożywieniem. Ostatnie badania uznają witC za ważny kofaktor rodziny dioksygenaz Fe(II) i 2-oksoglutaranu. Należą do nich enzymy TET, które biorą udział w konwersji 5-metylocytozyny (5-mC) do jej utlenionych pochodnych 5-hydroksymetylocytozyny (5-hmC), 5-karboksycytozyny (5-caC) i 5-formylcytozyny (5-hmC). -fC) i enzymy Jumonji, które biorą udział w demetylacji histonów. W związku z tym witC może potencjalnie odgrywać ważną rolę w regulacji demetylacji DNA i histonów. Jednak > 80 procent pacjentów z rakiem hematologicznym miało poważny niedobór witaminy C. Co ciekawe, analizy 20 uczestników włączonych do niedawno przeprowadzonego przez badaczy randomizowanego, kontrolowanego placebo badania pilotażowego (NCT02877277) pokazują, że poziom witC u pacjentów z MDS i CMML poddawanych leczeniu azacytydyną można łatwo podnieść do normalnego zakresu przez doustną suplementację witC (dane niepublikowane). Kiedy pacjenci, którzy już przyjmowali suplementy witaminy C, zostali przestawieni na placebo, poziomy witaminy C szybko spadły poniżej normalnego zakresu.

Wykazano również, że tworzenie 5-hmC i jego pochodnych może być upośledzone u osób zdrowych i pacjentów z mutacjami TET. Ponieważ jednak wiele z tych mutacji jest heterozygotycznych, a trzy enzymy TET (TET1, TET2 i TET3) mogą wykazywać pewną redundancję, przywrócenie witC do poziomów fizjologicznych może mieć wpływ na poziom 5-hmC/5-mC u osób z hematopoezą klonalną z mutacją TET lub rakiem hematologicznym.

Analizy poziomów 5-hmC/5-mC w komórkach jednojądrzastych (MNC) krwi obwodowej (PB) od uczestników badania pilotażowego również wykazały wyraźną tendencję do wzrostu 5-hmC w ramieniu z witC, jednak po zaprojektowaniu badania badacze zdali sobie sprawę, że poziomy 5-hmC/5-mC są lepiej mierzone w hematopoetycznych komórkach macierzystych w szpiku kostnym (BM), gdzie poziomy są 10-20 razy wyższe. W związku z tym badanie pilotażowe zostanie uzupełnione randomizowaną, kontrolowaną placebo próbą doustnej witaminy C u osób z nowotworami szpiku niskiego ryzyka; tj. CCUS lub MDS/CMML niskiego ryzyka, w celu zbadania, czy doustna witamina C może zmienić biologię tych jednostek chorobowych i ostatecznie zapobiec postępowi.

hipotezy:

1. Badacze i współpracownicy wykazali wcześniej, że pacjenci z rakiem mają niedobór witaminy C, a osoby z CCUS, który reprezentuje stan przed MDS, mogą również mieć niedobór witaminy C. Hipoteza jest taka, że ​​może to prowadzić do obniżonych poziomów 5-hmC/5-mC in vivo zarówno u pacjentów z rakiem, jak i osób z CCUS

2. Podniesienie poziomu witC w surowicy do normalnego zakresu u pacjentów z CCUS i MDS/CMML niskiego ryzyka poprzez doustną suplementację witC może

   • zmniejszyć złośliwy klon,
   • zwiększyć stosunek 5-hmC/5-mC,
   • zmienić profil cytokin w osoczu na mniej zapalny, mniej rakotwórczy,
   • zmienić ekspresję genów

Celuje:

Aby określić, czy przywrócenie witC do normalnego zakresu u pacjentów z CCUS i MDS/CMML niskiego ryzyka może:

1. zmniejszyć złośliwy klon,
2. zwiększyć stosunek 5-hmC/5-mC u pacjentów z CCUS i MDS/CMML niskiego ryzyka
3. zmniejszyć akumulację 5-mC w promotorach/wzmacniaczach/długich powtórzeniach końcowych (LTR) lub w innych regulacyjnych regionach genomowych supresorów nowotworów/metylowanych genów sterujących/genów zaangażowanych w rozwój hematopoetyczny,
4. zwiększyć ekspresję tych genów,
5. zmienić profil cytokin w osoczu,
6. zmieniać przepuszczalność jelit (mierzoną stężeniem bakteryjnego DNA we krwi obwodowej) i/lub skład mikroflory jelitowej,
7. pociągać za sobą żadnego zagrożenia dla bezpieczeństwa.

PLAN BADAŃ Planuje się włączenie do badania 100 pacjentów. Osoby z CCUS, MDS niskiego ryzyka lub CMML-0 lub -1 zostaną włączone do Rigshospitalet, Herlev University Hospital, Odense University Hospital, Aalborg University Hospital lub Keck Hospital of University of Southern California w okresie od listopada 2017 do grudnia 2021.

Uczestnicy wezmą udział w losowaniu blokowym w stosunku 1:1; witC 1000 mg/dzień p.o. w porównaniu z placebo przez rok.

Planuje się przyjęcie do 30 zdrowych ochotników w podeszłym wieku. Ilość i rodzaj bakteryjnego DNA w PB zostanie określona i posłuży jako kontrola.

MATERIAŁY I POMIARY PB: Próbki PB (45 ml) zostaną pobrane na początku badania i co 3 miesiące (lub częściej, jeśli jest to wymagane zgodnie z wyborem lekarza) w ciągu pierwszego roku.

Pomiary obejmują morfologię krwi, w tym liczbę różnicową, poziomy kwasu foliowego, witaminy B12, witaminy D, żelaza, ferrytyny, transferyny, nasycenia transferyny, poziomu witaminy C w osoczu, cytokin i zawartości DNA bakterii (w odniesieniu do DNA bakterii na skórze pacjenta iw kale) .

BM: Próbki BM (18 ml) zostaną pobrane na początku badania, po 3 miesiącach i po roku.

Zostaną zmierzone poziomy witC i różnych cytokin. Mutacje w genach często zaangażowanych w raka szpiku/klonalną hematopoezę, w tym regulatorów epigenetycznych i częstości alleli wariantów (VAF) będą badane przez ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji w sortowanych komórkach BM CD34+ (jeśli są dostępne) lub frakcji BM ujemnej sortowania CD34+ na początku badania , po 3 miesiącach i po roku.

Sekwencjonowanie RNA i całkowita ocena 5-hmC/5-mC zostaną przeprowadzone na hematopoetycznych komórkach macierzystych BM CD34+.

Kał: Próbki kału (9 ml) będą pobierane od podgrupy pacjentów na początku badania, po 3 miesiącach i po roku. DNA bakterii zostanie wyekstrahowane i zsekwencjonowane.

BIOBANK BADAWCZY Biobank badawczy zostanie utworzony w Laboratorium Epi-/Genome, Rigshospitalet / Centrum Badań i Innowacji Biotechnologii w celu przechowywania próbek biologicznych od uczestników. Biobank naukowy jest zatwierdzony przez Regionalną Komisję Etyki Nauki oraz Duńską Agencję Ochrony Danych zgodnie z ustawą o przetwarzaniu danych osobowych (licencja nr. odpowiednio H-16022249 i 04864/RH-2016-259). Kriokonserwowane oddzielone MNC z BM i PB będą przechowywane oprócz peletek granulocytów i osocza. Termin zamknięcia biobanku badawczego to 31-12-2030.

Do badań korelacyjnych próbki biologiczne zostaną przesłane do Van Andel Research Institute w Grand Rapids w USA i Imperial College w Londynie w Wielkiej Brytanii (współpracownicy zewnętrzni) w celu sekwencjonowania RNA i analiz odpowiednio metylacji i hydroksymetylacji DNA. Próbki biologiczne zostaną również przesłane do Wydziału Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu w Kopenhadze oraz do Narodowego Instytutu Weterynarii Uniwersytetu Technicznego w Danii (współpracownicy zewnętrzni) w celu odpowiednio pomiaru stężenia witaminy C w surowicy i analizy odpowiedzi limfocytów T.

METODY Pomiar witC: Askorbinian i całkowita witC, tj. askorbinian + kwas dehydroaskorbinowy (utleniona postać witC; DHA), oznacza się ilościowo metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją kulometryczną; DHA ocenia się przez odjęcie askorbinianu od całkowitej witC. Kwas moczowy jest stosowany jako endogenny wzorzec wewnętrzny.

Sortowanie komórek: sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS, przy użyciu urządzenia EasySep).

Całkowity pomiar 5-hmC/5-mC: Analiza punktowa 5-hmC. Pomiar 5-hmC/5-mC za pomocą spektrometrii mas.

Specyficzny dla locus pomiar 5-hmC/5-mC: „EPIC” 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC w wybranych miejscach będzie mierzone metodą pirosekwencjonowania.

Ekspresja genów: sekwencjonowanie całkowitego RNA i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkryptazą.

Wykrywanie mutacji: Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji panelu genów powtarzających się mutacji w raku szpiku, zgodnie z opisem.

UWAGI STATYSTYCZNE I OBLICZANIE MOCY To badanie jest pierwszym badaniem, w którym zbadano wpływ witC w monoterapii na poziomy 5-hmC/5-mC w hematopoetycznych komórkach macierzystych u ludzi in vivo. W związku z tym nie jest możliwe wykonanie obliczenia mocy ani obliczenia wielkości próbki. Liczbę uczestników (n=100) ustalono jako szacunkową liczbę potrzebną do zaobserwowania potencjalnie istotnej różnicy między grupami (vitC vs. placebo) w pierwszorzędowym punkcie końcowym; mediana zmiany VAF mutacji somatycznych od wartości wyjściowej do 12 miesięcy.

Analizy skuteczności są zgodne z zamiarem leczenia. Analizy bezpieczeństwa obejmują wszystkich uczestników, którzy otrzymali co najmniej jedną dawkę terapii według protokołu.

UWAGI ETYCZNE Badanie zostało zatwierdzone przez Regionalną Komisję Etyki Nauki (H-16022249) oraz Duńską Agencję Ochrony Danych (04864/RH-2016-259).

Wszyscy uczestnicy objęci projektem zostaną poinformowani ustnie i pisemnie. Uczestnictwo będzie akceptowane wyłącznie po wyrażeniu pisemnej zgody. Uczestnicy zostaną poinformowani, że mogą w każdej chwili z dowolnej przyczyny wycofać się z badania bez wpływu na ich leczenie w systemie opieki zdrowotnej.

Stosując opisane podejście ukierunkowane na sekwencjonowanie DNA, istnieje niewielkie ryzyko wykrycia mutacji linii zarodkowej u uczestników związanej ze złośliwym nowotworem szpikowym. Uczestnicy zostaną poproszeni o zaznaczenie w świadomej zgodzie, czy nie chcą otrzymywać dalszych istotnych informacji zdrowotnych, które mogą pojawić się podczas analiz projektu. O ile uczestnik wyraźnie nie oświadczy, że nie chce być informowany o jakichkolwiek potencjalnych przypadkowych wynikach badania związanych ze zdrowiem, zostanie o tym poinformowany i w przypadku przypadkowych wyników zostaną mu zaproponowane dalsze badania i poradnictwo genetyczne w lokalnym szpitalu.

Wady pacjentów, działania niepożądane, ryzyko i powikłania Pobieranie krwi wiąże się z krótkotrwałym dyskomfortem i/lub bólem. Z pobieraniem krwi nie wiąże się żadne znaczące ryzyko. Może wystąpić miejscowe krwawienie, które w rzadkich przypadkach może powodować dyskomfort i przebarwienia przez kilka dni. Rzadko pobieranie krwi może wywołać reakcję wazowagalną prowadzącą do krótkiej utraty przytomności.

Aspiracja BM wiąże się z krótkotrwałym bólem podczas podawania znieczulenia miejscowego. Ponadto wiele osób odczuwa nieprzyjemne uczucie w pośladkach i nodze podczas aspiracji BM. Trwa to około 30 sekund. Wreszcie, przez kilka dni po zabiegu może wystąpić pewna tkliwość. Możliwe powikłania związane z badaniem BM obejmują krwawienie i infekcję. Częstość występowania tych powikłań jest jednak bardzo niska.

Zgodnie z Zaleceniami Nordic Nutrition nie ma dowodów na to, że spożycie witaminy C powyżej 1000 mg/dobę ma działanie rakotwórcze lub teratogenne. Jednak wysokie spożycie (> 1000-2000 mg/dzień) może powodować biegunkę i inne zaburzenia żołądkowo-jelitowe, a osoby podatne mogą doświadczać tworzenia się kamieni nerkowych w wyniku zwiększonego tworzenia się szczawianów. Ponieważ witamina C jest podawana tylko w dawkach fizjologicznych, przewiduje się, że badanie jest bezpieczne i nie będzie stanowić dodatkowego ryzyka dla uczestników; założenie, które jest poparte doświadczeniem z badania pilotażowego.