Epigenetikk, C-vitamin og unormal dannelse av blodceller - C-vitamin hos pasienter med lavrisiko myeloide maligniteter (EVITA)

BAKGRUNN Nyere undersøkelser har vist at mutasjoner i epigenetiske regulatorer er vanlige, både i den tilsynelatende normal hematopoiesis hos eldre og hos pasienter (pts) med myeloid kreft. Det var lenge forventet at DNA-metylering var et permanent dempende merke, men med oppdagelsen av de ti elleve translokasjonsenzymene (TET) ble det klart at aktiv demetylering forekommer. De første trinnene i denne prosessen katalyseres av TET-enzymer, som imidlertid ofte muteres og metyleres i hematologiske kreftformer. Jumonji-enzymene, som katalyserer histon-demetylering, er også avvikende regulert i hematologiske kreftformer.

Vitamin C (VitC) ble identifisert på 1930-tallet som det nødvendige mikronæringsstoffet for å forebygge skjørbuk. I motsetning til planter og de fleste dyr, er mennesker ikke i stand til å syntetisere vitC fra glukose på grunn av mangel på det nødvendige enzymet, L-gulonolaktonoksidase. Derfor må vitC tilføres gjennom kosten. Nyere studier anerkjenner vitC som en viktig kofaktor for Fe(II)- og 2-oksoglutaratdioksygenasefamilien. Disse inkluderer TET-enzymer, som er involvert i omdannelsen av 5-metylcytosin (5-mC) til dets oksiderte derivater 5-hydroksymetylcytosin (5-hmC), 5-karboksylcytosin (5-caC) og 5-formylcytosin (5) -fC), og Jumonji-enzymene som er involvert i histondemetylering. Følgelig kan vitC potensielt spille en viktig rolle i reguleringen av DNA og histon demetylering. Imidlertid ble > 80 prosent av hematologiske kreftpkt funnet å være alvorlig vitC-mangel. Interessant nok viser analyser av 20 deltakere inkludert i etterforskernes nylig utførte randomiserte, placebokontrollerte pilotstudie (NCT02877277) at nivået av vitC i MDS og CMML pts som gjennomgår behandling med azacitidin, lett heves til normalområdet ved oralt vitC-tilskudd. (upubliserte data). Når pts som allerede tok vitC-tilskudd ble byttet til placebo, falt vitC-nivåene raskt under normalområdet.

Det har også blitt vist at dannelsen av 5-hmC og dets derivater kan bli kompromittert hos friske individer og pts med TET-mutasjoner. Siden mange av disse mutasjonene er heterozygote, og siden de tre TET-enzymene (TET1, TET2 og TET3) kan ha en viss redundans, kan gjenoppretting av vitC til fysiologiske nivåer ha en innvirkning på nivået av 5-hmC/5-mC hos individer med TET-mutant klonal hematopoiesis eller hematologisk kreft.

Analyser av 5-hmC/5-mC-nivåer i perifert blod (PB) mononukleære celler (MNC) fra deltakerne i pilotstudien viste også en klar trend mot økt 5-hmC i vitC-armen, men etter utformingen av studien etterforskere innså at 5-hmC/5-mC-nivåer er bedre målt i hematopoietiske stamceller i benmargen (BM) hvor nivåene er 10-20 ganger høyere. Pilotstudien vil derfor bli fulgt opp med en randomisert placebokontrollert studie av oral vitC hos individer med lavrisiko myeloide maligniteter; dvs. CCUS eller lavrisiko MDS/CMML, for å undersøke om oral vitC kan endre biologien til disse sykdomsenhetene og til slutt forhindre progresjon.

Hypoteser:

1. Etterforskerne og samarbeidspartnerne har tidligere vist at kreftpkt er vitC-mangel, og individer med CCUS, som representerer pre-MDS, kan også ha vitC-mangel. Hypotesen er at dette kan føre til reduserte nivåer av 5-hmC/5-mC in vivo i både kreftpkt og personer med CCUS

2. Heving av serum vitC-nivåer til normalområdet i CCUS og lavrisiko MDS/CMML-pkt ved oral tilskudd med vitC kan

   • redusere den ondartede klonen,
   • øke 5-hmC/5-mC-forholdet,
   • endre plasmacytokinprofilen mot en mindre inflammatorisk, mindre tumorigen profil,
   • endre genuttrykk

Mål:

For å finne ut om gjenoppretting av vitC til normalområdet i CCUS og lavrisiko MDS/CMML pts kan:

1. redusere den ondartede klonen,
2. øke 5-hmC/5-mC-forholdet i CCUS og lavrisiko MDS/CMML-poeng
3. redusere akkumulering av 5-mC ved promotere/enhancers/long terminal repeats (LTRs), eller ved andre regulatoriske genomiske regioner av tumorsuppressorer/metylerte drivergener/gener involvert i hematopoietisk utvikling,
4. oppregulere uttrykket av disse genene,
5. endre plasmacytokinprofilen,
6. endre intestinal permeabilitet (målt ved konsentrasjon av bakteriell DNA i perifert blod) og/eller sammensetning av tarmmikrobiota,
7. innebære noen sikkerhetsrisiko.

FORSKNINGSPLAN Totalt er det planlagt 100 pasienter. Personer med CCUS, lavrisiko MDS eller CMML-0 eller -1 vil bli inkludert fra Rigshospitalet, Herlev Universitetssykehus, Odense Universitetssykehus, Aalborg Universitetssykehus eller Keck Hospital ved Universitetet i Sør-California mellom november 2017-desember 2021.

Deltakerne vil gå inn i blokkrandomisering med et forhold på 1:1; vitC 1000 mg/dag p.o. versus placebo i ett år.

Det er planlagt inntil 30 friske eldre frivillige. Mengde og type bakteriell DNA i PB vil bli bestemt og tjene som kontroller.

MATERIALE OG MÅLINGER PB: PB-prøver (45 mL) vil bli tatt ved studiestart og hver 3. måned (eller mer hvis nødvendig i henhold til legens valg) i løpet av det første året.

Målinger inkluderer blodtellinger inkludert differensialtall, nivåer av folsyre, vitamin B12, vitamin D, jern, ferritin, transferrin, transferrinmetning, plasma vitC-nivåer, cytokiner og bakterielt DNA-innhold (referert til bakteriell DNA på pasientens hud og i avføring) .

BM: BM-prøver (18 mL) vil bli tatt ved studiestart, etter 3 måneder og etter ett år.

Nivåer av vitC og ulike cytokiner vil bli målt. Mutasjoner i gener som ofte er involvert i myeloid kreft/klonal hematopoiesis, inkludert epigenetiske regulatorer, og variant allel frekvenser (VAF) vil bli undersøkt ved målrettet neste generasjons sekvensering i sorterte BM CD34+ celler (hvis tilgjengelig) eller BM negativ fraksjon av CD34+ sortering ved studiestart , etter 3 måneder og etter ett år.

RNA-sekvensering og total 5-hmC/5-mC-vurdering vil bli utført på BM CD34+ hematopoietiske stamceller.

Avføring: Avføringsprøver (9 mL) vil bli samlet inn fra en undergruppe av pasienter ved studiestart, etter 3 måneder og etter ett år. Bakterie-DNA vil bli ekstrahert og sekvensert.

FORSKNINGSBIOBANK Det skal etableres en forskningsbiobank ved Epi-/Genomlaboratoriet, Rigshospitalet / Bioteknologisk Forsknings- og Innovasjonssenter for å lagre de biologiske prøvene fra deltakerne. Forskningsbiobanken er godkjent av den regionale vitenskapsetiske komité og Datatilsynet i henhold til lov om behandling av personopplysninger (lisensnr. henholdsvis H-16022249 og 04864/RH-2016-259). Kryokonserverte separerte MNC-er fra BM og PB vil bli lagret i tillegg til granulocyttpellets og plasma. Datoen for nedleggelse av forskningsbiobanken er 31.12.2030.

For korrelative studier vil biologiske prøver bli sendt til Van Andel Research Institute, Grand Rapids, USA, og Imperial College, London, Storbritannia (eksterne samarbeidspartnere), for RNA-sekvensering og analyser av henholdsvis DNA-metylering og hydroksymetylering. Biologiske prøver vil også bli sendt til Biovitenskapsfakultetet, Københavns Universitet og Statens Veterinærinstitutt, Danmarks Tekniske Universitet (eksterne samarbeidspartnere) for henholdsvis måling av serum vitC-konsentrasjoner og analyser av T-celleresponser.

METODER VitC-måling: Askorbat og total vitC, dvs. askorbat + dehydroaskorbinsyre (den oksiderte formen av vitC; DHA), kvantifiseres ved høyytelses væskekromatografi (HPLC) med coulometrisk deteksjon; DHA vurderes ved subtraksjon av askorbat fra total vitC. Urinsyre brukes som endogen intern standard.

Cellesortering: Magnetisk aktivert cellesortering (MACS, ved hjelp av en EasySep-enhet).

Total 5-hmC/5-mC-måling: Dot blot-analyse av 5-hmC. 5-hmC/5-mC-måling ved massespektrometri.

Lokusspesifikk 5-hmC/5-mC-måling: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC på utvalgte steder vil bli målt ved pyrosekvensering.

Genekspresjon: Total RNA-sekvensering og revers transkriptase-kvantitativ polymerasekjedereaksjon.

Mutasjonsdeteksjon: Målrettet neste generasjons sekvensering av et panel av gener som gjentatte ganger er mutert i myeloid kreft som beskrevet.

STATISTISKE VURDERINGER OG KRAFTBEREGNING Denne studien er den første studien som undersøker effekten av vitC som monoterapi på 5-hmC/5-mC-nivåer i hematopoietiske stamceller hos mennesker in vivo. Derfor er det ikke mulig å utføre en effektberegning eller en prøvestørrelsesberegning. Antall deltakere (n=100) er satt som et estimat av antallet som trengs for å observere en potensiell signifikant forskjell mellom gruppene (vitC vs. placebo) i det primære endepunktet; median endring i VAF av somatiske mutasjoner fra baseline til 12 måneder.

Effektanalyser er basert på intensjon å behandle. Sikkerhetsanalyser inkluderer alle deltakere som får minst én dose protokollbehandling.

ETISKE HENSYN Studien er godkjent av den regionale vitenskapsetiske komité (H-16022249) og det danske datatilsynet (04864/RH-2016-259).

Alle deltakere som inngår i prosjektet vil bli informert muntlig og skriftlig. Deltakelse vil kun bli akseptert etter skriftlig samtykke. Deltakerne vil bli informert om at de når som helst uansett årsak kan trekke seg fra studien uten at det påvirker deres behandling i helsevesenet.

Ved å bruke den beskrevne målrettede DNA-sekvenseringsmetoden, er det en liten risiko for å oppdage en kimlinjemutasjon hos deltakerne relatert til myeloid malignitet. Deltakerne vil bli bedt om å oppgi i det informerte samtykket dersom de ikke ønsker å motta ytterligere relevant helserelatert informasjon som kan dukke opp under prosjektanalysene. Med mindre deltakeren uttrykkelig oppgir at han eller hun ikke ønsker å bli informert om eventuelle helserelaterte tilfeldige funn i studien, vil deltakeren bli informert og tilbudt ytterligere undersøkelser og genetisk veiledning ved lokalsykehuset ved tilfeldige funn.

Pasientulemper, bivirkninger, risiko og komplikasjoner Blodprøvetaking er assosiert med kortvarig ubehag og/eller smerte. Det er ingen signifikant risiko forbundet med blodprøvetakingen. Lokale blødninger kan oppstå, som i sjeldne tilfeller kan gi ubehag og misfarging i noen dager. I sjeldne tilfeller kan en blodprøve forårsake vasovagal reaksjon som fører til et kort bevissthetstap.

BM-aspirasjon er forbundet med korte smerter mens lokalbedøvelsen gis. Videre opplever mange individer en ubehagelig følelse i nas og bein mens BM aspireres. Dette varer i omtrent 30 sekunder. Til slutt kan det oppstå noe ømhet i noen dager etter inngrepet. Mulige komplikasjoner for å gjennomgå en BM-undersøkelse inkluderer blødning og infeksjon. Imidlertid er forekomsten av disse komplikasjonene ekstremt lav.

I følge de nordiske ernæringsanbefalingene er det ingen holdepunkter for at inntak av vitC over 1000 mg/dag er verken kreftfremkallende eller teratogent. Høyt inntak (> 1000-2000 mg/dag) kan imidlertid forårsake diaré og andre gastrointestinale forstyrrelser, og mottakelige individer kan oppleve nyresteindannelse fra økt oksalatdannelse. Siden vitC kun gis i fysiologiske doser, forventes det at studien er trygg og vil ikke gi noen ytterligere risiko for deltakerne; en antakelse som støttes av erfaringene fra pilotstudien.