Epigenetika, vitamín C a abnormální tvorba krevních buněk – vitamín C u pacientů s nízkorizikovými myeloidními malignitami (EVITA)

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY Nedávné výzkumy ukázaly, že mutace v epigenetických regulátorech jsou běžné, a to jak u zdánlivě normální hematopoézy starších osob, tak u pacientů (pts) s myeloidními rakovinami. Dlouho se očekávalo, že methylace DNA je trvalou umlčující značkou, ale s objevem deseti jedenácti translokačních (TET) enzymů bylo jasné, že dochází k aktivní demetylaci. Počáteční kroky tohoto procesu jsou katalyzovány TET enzymy, které jsou však u hematologických karcinomů často mutovány a metylovány. Enzymy Jumonji, které katalyzují demetylaci histonů, jsou také aberantně regulovány u hematologických rakovin.

Vitamin C (VitC) byl identifikován ve 30. letech 20. století jako nezbytná mikroživina v prevenci kurděje. Na rozdíl od rostlin a většiny zvířat nejsou lidé schopni syntetizovat vitC z glukózy kvůli nedostatku požadovaného enzymu, L-gulonolaktonoxidázy. Proto musí být vitC dodáván prostřednictvím stravy. Nedávné studie uznávají vitC jako důležitý kofaktor pro rodinu Fe(II)- a 2-oxoglutarát dioxygenázy. Patří mezi ně enzymy TET, které se podílejí na přeměně 5-methylcytosinu (5-mC) na jeho oxidované deriváty 5-hydroxymethylcytosin (5-hmC), 5-karboxylcytosin (5-caC) a 5-formylcytosin (5 -fC) a enzymy Jumonji, které se podílejí na demetylaci histonů. VitC tedy může potenciálně hrát důležitou roli v regulaci DNA a demetylace histonů. Bylo však zjištěno, že > 80 procent pacientů s hematologickým karcinomem má závažný nedostatek vitC. Zajímavé je, že analýzy 20 účastníků zahrnutých do nedávno provedené randomizované, placebem kontrolované pilotní studie (NCT02877277) ukazují, že hladina vitC u pacientů s MDS a CMML podstupujících léčbu azacitidinem je snadno zvýšena na normální rozmezí perorálním doplňkem vitC (nepublikované údaje). Když pacienti, kteří již užívali doplňky vitC, přešli na placebo, hladiny vitC rychle klesly pod normální rozmezí.

Bylo také prokázáno, že tvorba 5-hmC a jeho derivátů může být ohrožena u zdravých jedinců a pacientů s TET mutacemi. Protože však mnoho z těchto mutací je heterozygotních a protože tři enzymy TET (TET1, TET2 a TET3) mohou mít určitou redundanci, obnovení vitC na fyziologické hladiny může mít dopad na hladinu 5-hmC/5-mC. u jedinců s TET mutantní klonální hematopoézou nebo hematologickou rakovinou.

Analýzy hladin 5-hmC/5-mC v mononukleárních buňkách periferní krve (PB) od účastníků pilotní studie také ukázaly jasný trend ke zvýšení 5-hmC ve větvi vitC, nicméně po navržení studie výzkumníci si uvědomili, že hladiny 5-hmC/5-mC se lépe měří v hematopoetických kmenových buňkách v kostní dřeni (BM), kde jsou hladiny 10-20krát vyšší. Na pilotní studii bude tedy navazovat randomizovaná placebem kontrolovaná studie perorálního vitC u jedinců s nízkým rizikem myeloidních malignit; tj. CCUS nebo MDS/CMML s nízkým rizikem, aby se zjistilo, zda orální vitC může změnit biologii těchto chorobných jednotek a nakonec zabránit progresi.

hypotézy:

1. Výzkumníci a spolupracovníci již dříve prokázali, že pacienti s rakovinou mají nedostatek vitC a jedinci s CCUS, který představuje pre-MDS, mohou mít také nedostatek vitC. Hypotézou je, že to může vést ke snížení hladin 5-hmC/5-mC in vivo jak u pacientů s rakovinou, tak u jedinců s CCUS

2. Zvýšení hladin vitC v séru na normální rozmezí u pacientů s CCUS a pacientů s nízkým rizikem MDS/CMML perorální suplementací vitC může

   • redukovat maligní klon,
   • zvýšit poměr 5-hmC/5-mC,
   • změnit profil plazmatických cytokinů směrem k méně zánětlivému, méně tumorigennímu profilu,
   • změnit genovou expresi

Cíle:

Chcete-li zjistit, zda obnovení vitC do normálního rozmezí u pacientů s CCUS a nízkorizikových MDS/CMML může:

1. redukovat maligní klon,
2. zvýšit poměr 5-hmC/5-mC u pacientů s CCUS a MDS/CMML s nízkým rizikem
3. snížit akumulaci 5-mC v promotorech/zesilovačích/dlouhých terminálních repeticích (LTR) nebo v jiných regulačních genomových oblastech tumor supresorů/methylovaných řídících genů/genů zapojených do hematopoetického vývoje,
4. upregulovat expresi těchto genů,
5. změnit profil plazmatických cytokinů,
6. změnit střevní propustnost (měřenou koncentrací bakteriální DNA v periferní krvi) a/nebo složení střevní mikroflóry,
7. nést jakákoli bezpečnostní rizika.

VÝZKUMNÝ PLÁN Celkem je plánováno zařazení 100 pacientů. Jednotlivci s CCUS, MDS s nízkým rizikem nebo CMML-0 nebo -1 budou zahrnuti z Rigshospitalet, univerzitní nemocnice Herlev, univerzitní nemocnice v Odense, univerzitní nemocnice v Aalborgu nebo nemocnice Keck z University of Southern California v období od listopadu 2017 do prosince 2021.

Účastníci vstoupí do blokové randomizace v poměru 1:1; vitC 1000 mg/den p.o. oproti placebu po dobu jednoho roku.

Je plánováno přihlášení až 30 zdravých starších dobrovolníků. Množství a typ bakteriální DNA v PB bude určeno a bude sloužit jako kontrola.

MATERIÁL A MĚŘENÍ PB: Vzorky PB (45 ml) budou odebrány při vstupu do studie a každé 3 měsíce (nebo více, pokud je to požadováno podle volby lékaře) během prvního roku.

Měření zahrnuje krevní obraz včetně diferenciálního počtu, hladiny kyseliny listové, vitaminu B12, vitaminu D, železa, feritinu, transferinu, saturace transferinu, hladiny vitC v plazmě, cytokinů a obsahu bakteriální DNA (vztaženo na bakteriální DNA na kůži pacienta a ve stolici) .

BM: Vzorky BM (18 ml) budou odebrány při vstupu do studie, po 3 měsících a po jednom roce.

Budou měřeny hladiny vitC a různých cytokinů. Mutace v genech často podílejících se na myeloidní rakovině/klonální hematopoéze, včetně epigenetických regulátorů, a frekvence variant alel (VAF) budou zkoumány cíleným sekvenováním nové generace v tříděných BM CD34+ buňkách (pokud jsou k dispozici) nebo BM negativní frakci CD34+ třídění při vstupu do studie , po 3 měsících a po roce.

Sekvenování RNA a celkové hodnocení 5-hmC/5-mC bude provedeno na BM CD34+ hematopoetických kmenových buňkách.

Výkaly: Vzorky výkalů (9 ml) budou odebrány podskupině pacientů při vstupu do studie, po 3 měsících a po jednom roce. Bakteriální DNA bude extrahována a sekvenována.

VÝZKUMNÁ BIOBANK V The Epi-/Genome Laboratory, Rigshospitalet / Biotech Research and Innovation Center bude zřízena výzkumná biobanka, která bude uchovávat biologické vzorky od účastníků. Výzkumná biobanka je schválena Regionálním vědeckým etickým výborem a Dánskou agenturou pro ochranu dat v souladu se zákonem o zpracování osobních údajů (licence č. H-16022249 a 04864/RH-2016-259, v tomto pořadí). Kromě granulocytových pelet a plazmy budou skladovány kryokonzervované separované MNC z BM a PB. Datum uzavření výzkumné biobanky je 31. 12. 2030.

Pro korelační studie budou biologické vzorky zaslány do Van Andel Research Institute, Grand Rapids, USA, a Imperial College, Londýn, Spojené království (externí spolupracovníci), pro sekvenování RNA a analýzy metylace DNA a hydroxymethylace, v daném pořadí. Biologické vzorky budou také zaslány na Fakultu přírodních věd Univerzity v Kodani a Národní veterinární institut, Dánská technická univerzita (externí spolupracovníci) pro měření koncentrací vitC v séru a analýzy odpovědí T buněk.

METODY Měření VitC: Askorbát a celkový vitC, tj. askorbát + kyselina dehydroaskorbová (oxidovaná forma vitC; DHA), se kvantifikují pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s coulometrickou detekcí; DHA se stanoví odečtením askorbátu od celkového vitC. Kyselina močová se používá jako endogenní vnitřní standard.

Třídění buněk: Magneticky aktivované třídění buněk (MACS, pomocí zařízení EasySep).

Celkové měření 5-hmC/5-mC: Dot blot analýza 5-hmC. Měření 5-hmC/5-mC hmotnostní spektrometrií.

Měření 5-hmC/5-mC specifické pro místo: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC na vybraných místech bude měřeno pyrosekvenováním.

Genová exprese: Sekvenování celkové RNA a reverzní transkriptáza-kvantitativní polymerázová řetězová reakce.

Detekce mutace: Cílené sekvenování nové generace panelu genů opakovaně mutovaných u myeloidní rakoviny, jak je popsáno.

STATISTICKÉ ÚVAHY A VÝPOČET SÍLY Tato studie je první studií zkoumající účinky vitC jako monoterapie na hladiny 5-hmC/5-mC v hematopoetických kmenových buňkách u lidí in vivo. Proto není možné provést výpočet výkonu nebo výpočet velikosti vzorku. Počet účastníků (n=100) je stanoven jako odhad počtu potřebných k pozorování potenciálního významného rozdílu mezi skupinami (vitC vs. placebo) v primárním koncovém bodě; medián změny VAF somatických mutací od výchozí hodnoty do 12 měsíců.

Analýzy účinnosti jsou založeny na záměru léčit. Bezpečnostní analýzy zahrnují všechny účastníky, kteří dostanou alespoň jednu dávku protokolární terapie.

ETICKÉ ÚVAHY Studie byla schválena Regionálním vědeckým etickým výborem (H-16022249) a Dánskou agenturou pro ochranu údajů (04864/RH-2016-259).

Všichni účastníci zapojení do projektu budou informováni ústně i písemně. Účast bude přijata pouze po písemném souhlasu. Účastníci budou informováni, že mohou kdykoli z jakéhokoli důvodu ze studie odstoupit, aniž by to mělo vliv na jejich léčbu v systému zdravotní péče.

Při použití popsaného přístupu cíleného sekvenování DNA existuje malé riziko detekce zárodečné mutace u účastníků související s myeloidní malignitou. Účastníci budou požádáni, aby v informovaném souhlasu uvedli, zda si nepřejí dostávat další relevantní informace týkající se zdraví, které se mohou objevit během analýz projektu. Pokud účastník výslovně neuvede, že si nepřeje být informován o jakýchkoli potenciálních náhodných nálezech souvisejících se zdravím ve studii, bude účastník informován a v případě náhodných nálezů mu budou nabídnuta další vyšetření a genetické poradenství v místní nemocnici.

Nevýhody pacienta, vedlejší účinky, rizika a komplikace Odběr krve je spojen s krátkým nepohodlím a/nebo bolestí. S odběrem krve nejsou spojena žádná významná rizika. Může dojít k místnímu krvácení, které může ve vzácných případech způsobit nepohodlí a změnu barvy na několik dní. Vzácně může odběr krve způsobit vazovagální reakci vedoucí ke krátké ztrátě vědomí.

Aspirace BM je spojena s krátkou bolestí při podání lokální anestezie. Kromě toho mnoho jedinců pociťuje nepříjemné pocity v oblasti nosu a nohou, když je BM odsávána. To trvá přibližně 30 sekund. Konečně se může několik dní po zákroku objevit určitá citlivost. Možné komplikace při vyšetření BM zahrnují krvácení a infekci. Výskyt těchto komplikací je však extrémně nízký.

Podle Nordic Nutrition Recommendations neexistuje žádný důkaz, že příjem vitC nad 1000 mg/den je karcinogenní nebo teratogenní. Vysoký příjem (> 1000-2000 mg/den) však může způsobit průjem a jiné gastrointestinální poruchy a u citlivých jedinců se může objevit tvorba ledvinových kamenů ze zvýšené tvorby oxalátů. Vzhledem k tomu, že vitC je podáván pouze ve fyziologických dávkách, očekává se, že studie je bezpečná a nepředstavuje pro účastníky žádné další riziko; předpoklad, který je podpořen zkušenostmi z pilotní studie.