Epigenetica, vitamine C en abnormale vorming van bloedcellen - Vitamine C bij patiënten met myeloïde maligniteiten met een laag risico (EVITA)

ACHTERGROND Recente onderzoeken hebben aangetoond dat mutaties in epigenetische regulatoren veel voorkomen, zowel bij de ogenschijnlijk normale hematopoëse van ouderen als bij patiënten (pts) met myeloïde kankers. Lang werd verwacht dat DNA-methylatie een permanent stilleggend kenmerk was, maar met de ontdekking van de tien elf translocatie (TET) enzymen werd duidelijk dat actieve demethylering optreedt. De eerste stappen in dit proces worden gekatalyseerd door TET-enzymen, die echter vaak worden gemuteerd en gemethyleerd bij hematologische kankers. De Jumonji-enzymen, die histon-demethylering katalyseren, worden ook afwijkend gereguleerd bij hematologische kankers.

Vitamine C (VitC) werd in de jaren 1930 geïdentificeerd als de noodzakelijke microvoedingsstof ter voorkoming van scheurbuik. In tegenstelling tot planten en de meeste dieren zijn mensen niet in staat om vitC uit glucose te synthetiseren vanwege een gebrek aan het vereiste enzym, L-gulonolactonoxidase. Daarom moet vitC via de voeding worden verstrekt. Recente studies erkennen vitC als een belangrijke cofactor voor de Fe(II)- en 2-oxoglutaraat dioxygenase familie. Deze omvatten de TET-enzymen, die betrokken zijn bij de omzetting van 5-methylcytosine (5-mC) in zijn geoxideerde derivaten 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), 5-carboxylcytosine (5-caC) en 5-formylcytosine (5- -fC), en de Jumonji-enzymen die betrokken zijn bij histondemethylering. Dienovereenkomstig kan vitC mogelijk een belangrijke rol spelen bij de regulatie van DNA en histondemethylering. Echter, > 80 procent van de patiënten met hematologische kanker bleek ernstig vitC-deficiënt te zijn. Interessant is dat analyses van 20 deelnemers aan de onlangs uitgevoerde gerandomiseerde, placebogecontroleerde pilotstudie van de onderzoekers (NCT02877277) aantonen dat het niveau van vitC in MDS- en CMML-patiënten die een behandeling met azacitidine ondergaan, gemakkelijk wordt verhoogd tot het normale bereik door oraal vitC-supplement. (ongepubliceerde gegevens). Toen patiënten die al vitC-supplementen gebruikten, overgingen op placebo, daalden de vitC-spiegels snel tot onder het normale bereik.

Er is ook aangetoond dat de vorming van 5-hmC en zijn derivaten kan worden aangetast bij gezonde personen en patiënten met TET-mutaties. Aangezien veel van deze mutaties echter heterozygoot zijn en aangezien de drie TET-enzymen (TET1, TET2 en TET3) enige redundantie kunnen hebben, kan herstel van vitC tot fysiologische niveaus een impact hebben op het niveau van 5-hmC/5-mC. bij personen met TET-gemuteerde klonale hematopoëse of hematologische kanker.

Analyses van 5-hmC/5-mC-spiegels in perifere bloed (PB) mononucleaire cellen (MNC's) van de deelnemers aan de pilotstudie lieten ook een duidelijke trend zien in de richting van verhoogde 5-hmC in de vitC-arm. onderzoekers realiseerden zich dat 5-hmC / 5-mC-niveaus beter worden gemeten in hematopoietische stamcellen in het beenmerg (BM) waar de niveaus 10-20 keer hoger zijn. De pilootstudie zal dus worden opgevolgd met een gerandomiseerde, placebogecontroleerde studie van orale vitC bij personen met myeloïde maligniteiten met een laag risico; d.w.z. CCUS of MDS/CMML met een laag risico, om te onderzoeken of orale vitC de biologie van deze ziekte-entiteiten kan veranderen en uiteindelijk progressie kan voorkomen.

Hypothesen:

1. De onderzoekers en medewerkers hebben eerder aangetoond dat patiënten met kanker vitC-deficiënt zijn, en personen met CCUS, dat pre-MDS vertegenwoordigt, kunnen ook vitC-deficiënt zijn. De hypothese is dat dit kan leiden tot verlaagde niveaus van 5-hmC/5-mC in vivo bij zowel patiënten met kanker als bij personen met CCUS

2. Het verhogen van serum vitC-spiegels tot het normale bereik in CCUS en laag-risico MDS/CMML-pts door orale suppletie met vitC kan

   • de kwaadaardige kloon verminderen,
   • verhoog de 5-hmC/5-mC-verhouding,
   • het plasmacytokineprofiel veranderen naar een minder inflammatoir, minder tumorverwekkend profiel,
   • genexpressie veranderen

Doelstellingen:

Om te bepalen of het herstellen van vitC naar het normale bereik in CCUS en laag-risico MDS/CMML-pts kan:

1. de kwaadaardige kloon verminderen,
2. verhoog de 5-hmC/5-mC-ratio in CCUS en MDS/CMML-patiënten met een laag risico
3. accumulatie van 5-mC bij promoters/enhancers/long terminal repeats (LTR's) of bij andere regulerende genomische regio's van tumorsuppressors/gemethyleerde drivergenen/genen die betrokken zijn bij hematopoëtische ontwikkeling verminderen,
4. de expressie van deze genen opwaarts reguleren,
5. het plasmacytokineprofiel veranderen,
6. verandering van de darmpermeabiliteit (gemeten aan de hand van de concentratie van bacterieel DNA in perifeer bloed) en/of de samenstelling van de darmmicrobiota,
7. eventuele veiligheidsrisico's met zich meebrengen.

ONDERZOEKSPLAN In totaal staan ​​100 patiënten gepland voor inschrijving. Personen met CCUS, MDS met een laag risico of CMML-0 of -1 zullen tussen november 2017 en december 2021 worden opgenomen in Rigshospitalet, Herlev University Hospital, Odense University Hospital, Aalborg University Hospital of Keck Hospital van University of Southern California.

De deelnemers zullen blokrandomisatie invoeren met een verhouding van 1:1; vitC 1000 mg/dag p.o. versus placebo gedurende een jaar.

Er zijn maximaal 30 gezonde oudere vrijwilligers gepland voor inschrijving. De hoeveelheid en het type bacterieel DNA in PB zal worden bepaald en dienen als controles.

MATERIAAL EN METINGEN PB: PB-monsters (45 ml) zullen worden genomen bij aanvang van het onderzoek en om de 3 maanden (of meer indien nodig volgens de keuze van de arts) gedurende het eerste jaar.

Metingen omvatten bloedtellingen inclusief differentiële telling, niveaus van foliumzuur, vitamine B12, vitamine D, ijzer, ferritine, transferrine, transferrineverzadiging, plasma vitC-niveaus, cytokines en bacterieel DNA-gehalte (verwezen naar bacterieel DNA op de huid van de patiënt en in de ontlasting) .

BM: BM-monsters (18 ml) worden genomen bij aanvang van het onderzoek, na 3 maanden en na een jaar.

Niveaus van vitC en verschillende cytokines zullen worden gemeten. Mutaties in genen die vaak betrokken zijn bij myeloïde kanker/klonale hematopoëse, inclusief epigenetische regulatoren, en variante allelfrequenties (VAF) zullen worden onderzocht door middel van gerichte volgende generatie sequencing in gesorteerde BM CD34+-cellen (indien beschikbaar) of BM-negatieve fractie van CD34+-sortering bij aanvang van de studie , na 3 maanden en na een jaar.

RNA-sequencing en totale 5-hmC/5-mC-bepaling zullen worden uitgevoerd op BM CD34+ hematopoietische stamcellen.

Ontlasting: ontlastingsmonsters (9 ml) zullen worden verzameld bij een subgroep van patiënten bij aanvang van het onderzoek, na 3 maanden en na een jaar. Bacterieel DNA zal worden geëxtraheerd en gesequenced.

ONDERZOEKSBIOBANK Er zal een onderzoeksbiobank worden opgericht in The Epi-/Genome Laboratory, Rigshospitalet / Biotech Research and Innovation Centre om de biologische monsters van de deelnemers op te slaan. De onderzoeksbiobank is goedgekeurd door de regionale wetenschapsethische commissie en het Deense bureau voor gegevensbescherming in overeenstemming met de wet op de verwerking van persoonsgegevens (licentienr. H-16022249 en 04864/RH-2016-259, respectievelijk). Gecryopreserveerde gescheiden MNC's van BM en PB zullen worden opgeslagen naast granulocytenpellets en plasma. De sluitingsdatum van de onderzoeksbiobank is 31-12-2030.

Voor correlatieve studies zullen biologische monsters worden verzonden naar Van Andel Research Institute, Grand Rapids, VS, en Imperial College, Londen, VK (externe medewerkers), voor respectievelijk RNA-sequencing en analyse van DNA-methylatie en hydroxymethylering. Biologische monsters zullen ook worden verzonden naar Life Science Faculty, Universiteit van Kopenhagen en The National Veterinary Institute, Technische Universiteit van Denemarken (externe medewerkers) voor respectievelijk meting van serumvitC-concentraties en analyse van T-celresponsen.

METHODEN VitC-meting: Ascorbaat en totaal vitC, d.w.z. ascorbaat + dehydroascorbinezuur (de geoxideerde vorm van vitC; DHA), worden gekwantificeerd door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met coulometrische detectie; DHA wordt bepaald door ascorbaat af te trekken van totaal vitC. Urinezuur wordt gebruikt als endogene interne standaard.

Celsortering: Magnetisch geactiveerde celsortering (MACS, met behulp van een EasySep-apparaat).

Totale 5-hmC/5-mC-meting: Dot-blot-analyse van 5-hmC. 5-hmC/5-mC-meting door middel van massaspectrometrie.

Locusspecifieke 5-hmC/5-mC-meting: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC op geselecteerde locaties zal worden gemeten door middel van pyrosequencing.

Genexpressie: totale RNA-sequencing en reverse transcriptase-kwantitatieve polymerasekettingreactie.

Mutatiedetectie: gerichte volgende generatie sequencing van een panel van genen die herhaaldelijk zijn gemuteerd in myeloïde kanker, zoals beschreven.

STATISTISCHE OVERWEGINGEN EN VERMOGENSBEREKENING Deze studie is de eerste studie die de effecten van vitC als monotherapie op 5-hmC/5-mC-niveaus in hematopoëtische stamcellen bij mensen in vivo onderzoekt. Daarom is het niet mogelijk om een ​​powerberekening of een berekening van de steekproefomvang uit te voeren. Het aantal deelnemers (n=100) is ingesteld als een schatting van het aantal dat nodig is om een ​​potentieel significant verschil tussen de groepen (vitC vs. placebo) in het primaire eindpunt waar te nemen; mediane verandering in VAF van somatische mutaties vanaf baseline tot 12 maanden.

Werkzaamheidsanalyses zijn door intention-to-treat. Veiligheidsanalyses omvatten alle deelnemers die ten minste één dosis protocoltherapie krijgen.

ETHISCHE OVERWEGINGEN Het onderzoek is goedgekeurd door de Regionale Wetenschapsethische Commissie (H-16022249) en het Deense bureau voor gegevensbescherming (04864/RH-2016-259).

Alle deelnemers aan het project worden mondeling en schriftelijk geïnformeerd. Deelname wordt alleen geaccepteerd na schriftelijke toestemming. Deelnemers zullen worden geïnformeerd dat ze zich op elk moment en om welke reden dan ook kunnen terugtrekken uit het onderzoek zonder dat dit gevolgen heeft voor hun behandeling in het gezondheidszorgsysteem.

Met behulp van de beschreven gerichte DNA-sequencingbenadering is er een klein risico op het detecteren van een kiembaanmutatie bij de deelnemers die verband houdt met myeloïde maligniteit. De deelnemers wordt gevraagd om in de geïnformeerde toestemming aan te geven of ze geen verdere relevante gezondheidsgerelateerde informatie willen ontvangen die tijdens de projectanalyses naar voren kan komen. Tenzij de deelnemer expliciet aangeeft dat hij of zij niet op de hoogte wil worden gehouden van mogelijke gezondheidsgerelateerde toevallige bevindingen in het onderzoek, wordt de deelnemer geïnformeerd en krijgt hij of zij verder onderzoek en erfelijkheidsadvisering aangeboden in het plaatselijke ziekenhuis in geval van willekeurige bevindingen.

Nadelen, bijwerkingen, risico's en complicaties voor de patiënt Bloedafname gaat gepaard met kortstondig ongemak en/of pijn. Aan de bloedafname zijn geen noemenswaardige risico's verbonden. Lokale bloedingen kunnen optreden, wat in zeldzame gevallen gedurende enkele dagen ongemak en verkleuring kan veroorzaken. In zeldzame gevallen kan een bloedafname een vasovagale reactie veroorzaken die leidt tot een kort bewustzijnsverlies.

BM-aspiratie wordt geassocieerd met korte pijn terwijl de lokale anesthesie wordt gegeven. Bovendien ervaren veel mensen een ongemakkelijk gevoel in de buik en het been terwijl de BM wordt opgezogen. Dit duurt ongeveer 30 seconden. Tot slot kan er enkele dagen na de ingreep enige gevoeligheid optreden. Mogelijke complicaties bij het ondergaan van een BM-onderzoek zijn bloedingen en infecties. De incidentie van deze complicaties is echter extreem laag.

Volgens de Nordic Nutrition Recommendations is er geen bewijs dat inname van vitC boven 1000 mg/dag kankerverwekkend of teratogeen is. Hoge innames (> 1000-2000 mg/dag) kunnen echter diarree en andere gastro-intestinale stoornissen veroorzaken en gevoelige personen kunnen niersteenvorming ervaren door verhoogde oxalaatvorming. Aangezien vitC alleen in fysiologische doses wordt gegeven, wordt verwacht dat het onderzoek veilig is en geen extra risico voor de deelnemers met zich meebrengt; een aanname die wordt ondersteund door de ervaring uit de pilotstudie.