表观遗传学、维生素 C 和异常血细胞形成 - 低风险骨髓恶性肿瘤患者的维生素 C (EVITA)

背景 最近的研究表明，表观遗传调节因子的突变在老年人表面正常的造血功能和骨髓癌患者 (pts) 中都很常见。 长期以来，人们一直认为 DNA 甲基化是一种永久性沉默标记，但随着 10-11 易位 (TET) 酶的发现，人们清楚地知道主动去甲基化的发生。 该过程的初始步骤由 TET 酶催化，然而，这些酶在血液癌症中经常发生突变和甲基化。 催化组蛋白去甲基化的 Jumonji 酶在血液癌症中也受到异常调节。

维生素 C (VitC) 在 1930 年代被确定为预防坏血病所必需的微量营养素。 与植物和大多数动物不同，由于缺乏所需的酶 L-古洛糖酸内酯氧化酶，人类无法从葡萄糖中合成 vitC。 因此，vitC 必须通过饮食来提供。 最近的研究认识到 vitC 是 Fe(II)- 和 2-氧代戊二酸双加氧酶家族的重要辅助因子。 这些包括 TET 酶，它们参与将 5-甲基胞嘧啶 (5-mC) 转化为其氧化衍生物 5-羟甲基胞嘧啶 (5-hmC)、5-羧基胞嘧啶 (5-caC) 和 5-甲酰胞嘧啶 (5 -fC)，以及参与组蛋白去甲基化的 Jumonji 酶。 因此，vitC 可能在 DNA 和组蛋白去甲基化的调节中发挥重要作用。 然而，发现超过 80% 的血液癌症患者严重缺乏 vitC。 有趣的是，对研究人员最近进行的随机、安慰剂对照试验研究 (NCT02877277) 中的 20 名参与者进行的分析表明，接受阿扎胞苷治疗的 MDS 和 CMML 患者的 vitC 水平很容易通过口服 vitC 补充剂升高至正常范围（未发表的数据）。 当已经服用 vitC 补充剂的患者改用安慰剂时，vitC 水平迅速降至正常范围以下。

还表明，5-hmC 及其衍生物的形成可能在健康个体和具有 TET 突变的患者中受到损害。 然而，由于这些突变中有许多是杂合的，并且由于三种 TET 酶（TET1、TET2 和 TET3）可能有一些冗余，因此将 vitC 恢复到生理水平可能会对 5-hmC/5-mC 水平产生影响在患有 TET 突变体克隆性造血或血液癌症的个体中。

对试点研究参与者外周血 (PB) 单核细胞 (MNC) 中 5-hmC/5-mC 水平的分析也显示出 vitC 组 5-hmC 增加的明显趋势，然而，在设计试验后研究人员意识到，在骨髓 (BM) 的造血干细胞中可以更好地测量 5-hmC/5-mC 水平，那里的水平要高 10-20 倍。 因此，该初步研究将在低风险骨髓恶性肿瘤患者中进行随机安慰剂对照试验进行后续研究；即 CCUS 或低风险 MDS/CMML，以研究口服 vitC 是否可以改变这些疾病实体的生物学并最终阻止进展。

假设：

1. 研究人员和合作者之前已经表明，癌症患者缺乏 vitC，代表 MDS 前期的 CCUS 患者也可能缺乏 vitC。 假设这可能导致癌症患者和 CCUS 患者体内 5-hmC/5-mC 水平降低

2. 通过口服补充 vitC 将 CCUS 和低风险 MDS/CMML 患者的血清 vitC 水平提高至正常范围可能

   • 减少恶性克隆，
   • 增加 5-hmC/5-mC 比率，
   • 将血浆细胞因子谱改变为炎症较少、致瘤性较低的谱，
   • 改变基因表达

目标：

确定是否将 CCUS 和低风险 MDS/CMML 患者的 vitC 恢复到正常范围可以：

1. 减少恶性克隆，
2. 增加 CCUS 和低风险 MDS/CMML 患者的 5-hmC/5-mC 比率
3. 减少 5-mC 在启动子/增强子/长末端重复序列 (LTR) 或肿瘤抑制因子/甲基化驱动基因/参与造血发育的基因的其他调控基因组区域的积累，
4. 上调这些基因的表达，
5. 改变血浆细胞因子谱，
6. 改变肠道通透性（通过外周血中细菌 DNA 的浓度测量）和/或肠道微生物群的组成，
7. 带来任何安全风险。

研究计划 计划招募总共 100 名患者。 2017 年 11 月至 2021 年 12 月期间，来自 Rigshospitalet、Herlev 大学医院、欧登塞大学医院、奥尔堡大学医院或南加州大学凯克医院的 CCUS、低风险 MDS 或 CMML-0 或 -1 患者将被纳入。

参与者将以1:1的比例进入区块随机化； vitC 1000 毫克/天口服与安慰剂对比一年。

计划招募30名健康老年志愿者。 PB 中细菌 DNA 的数量和类型将被确定并用作对照。

材料和测量 PB：PB 样品 (45 mL) 将在研究开始时和第一年内每 3 个月（或根据医生的选择需要更多）采集一次。

测量包括血液计数，包括分类计数、叶酸水平、维生素 B12、维生素 D、铁、铁蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白饱和度、血浆 vitC 水平、细胞因子和细菌 DNA 含量（参考患者皮肤和粪便中的细菌 DNA） .

BM：将在研究开始时、3 个月后和一年后采集 BM 样本 (18 mL)。

将测量 vitC 和各种细胞因子的水平。 经常参与骨髓癌/克隆性造血的基因突变，包括表观遗传调节因子和变异等位基因频率 (VAF)，将在研究开始时通过分选的 BM CD34+ 细胞（如果可用）或 BM 阴性分选的 CD34+ 细胞进行靶向下一代测序来研究, 3 个月后和一年后。

将对 BM CD34+ 造血干细胞进行 RNA 测序和总 5-hmC/5-mC 评估。

粪便：将在研究开始时、3 个月后和一年后从一部分患者中收集粪便样本 (9 mL)。 细菌 DNA 将被提取和测序。

研究生物库 研究生物库将在 Rigshospitalet / 生物技术研究与创新中心的 Epi-/Genome 实验室建立，以存储参与者的生物样本。 该研究生物样本库根据《个人数据处理法》（许可证号 100001）获得区域科学伦理委员会和丹麦数据保护局的批准。 H-16022249 和 04864/RH-2016-259）。 除粒细胞沉淀和血浆外，还将储存来自 BM 和 PB 的冷冻保存的分离 MNC。 关闭研究生物样本库的日期是 31-12-2030。

对于相关研究，生物样本将被送到美国大急流城的范安德尔研究所和英国伦敦的帝国理工学院（外部合作者），分别进行 RNA 测序和 DNA 甲基化和羟甲基化分析。 生物样本也将被送到哥本哈根大学生命科学学院和丹麦技术大学国家兽医学院（外部合作者），分别用于测量血清 vitC 浓度和分析 T 细胞反应。

方法 VitC 测量：抗坏血酸盐和总 vitC，即抗坏血酸盐 + 脱氢抗坏血酸（vitC 的氧化形式；DHA），通过具有库仑检测的高效液相色谱法 (HPLC) 进行量化； DHA 通过从总 vitC 中减去抗坏血酸来评估。 尿酸用作内源性内标。

细胞分选：磁激活细胞分选（MACS，使用 EasySep 设备）。

总 5-hmC/5-mC 测量：5-hmC 的斑点印迹分析。 通过质谱法进行 5-hmC/5-mC 测量。

位点特异性 5-hmC/5-mC 测量：“EPIC”850 K BeadChips。 将通过焦磷酸测序测量选定位点的 5-hmC/5-mC。

基因表达：总 RNA 测序和逆转录酶-定量聚合酶链反应。

突变检测：如前所述，对骨髓癌中反复发生突变的一组基因进行靶向下一代测序。

统计考虑和功效计算 本研究是第一个研究 vitC 作为单一疗法对体内人体造血干细胞 5-hmC/5-mC 水平影响的研究。 因此，无法执行功效计算或样本量计算。 参与者人数 (n=100) 被设置为观察主要终点中组间潜在显着差异（vitC 与安慰剂）所需人数的估计值；从基线到 12 个月体细胞突变 VAF 的中值变化。

疗效分析是通过意向治疗进行的。 安全性分析包括接受至少一剂方案治疗的所有参与者。

伦理考虑 该研究已获得区域科学伦理委员会 (H-16022249) 和丹麦数据保护局 (04864/RH-2016-259) 的批准。

将口头和书面通知项目中的所有参与者。 只有在获得书面同意后才会接受参与。 参与者将被告知，他们可以随时出于任何原因退出研究，而不会影响他们在医疗保健系统中的治疗。

使用所描述的靶向 DNA 测序方法，在参与者中检测到与骨髓恶性肿瘤相关的种系突变的风险很小。 如果参与者不想收到项目分析期间可能出现的任何进一步的健康相关信息，将要求参与者在知情同意书中声明。 除非参与者明确声明他或她不想被告知研究中任何潜在的与健康相关的随机发现，否则参与者将被告知并在随机发现的情况下在当地医院提供进一步的调查和遗传咨询。

患者的劣势、副作用、风险和并发症 血液采样与短暂的不适和/或疼痛有关。 没有重大风险与血液采样相关。 可能会发生局部出血，在极少数情况下会导致几天的不适和变色。 极少数情况下，采血会引起血管迷走神经反应，从而导致短暂的意识丧失。

BM 抽吸与局部麻醉时的短暂疼痛有关。 此外，许多人在吸入 BM 时会感到颈部和腿部不舒服。 这持续大约 30 秒。 最后，手术后几天可能会出现一些压痛。 进行 BM 检查可能出现的并发症包括出血和感染。 然而，这些并发症的发生率极低。

根据北欧营养建议，没有证据表明每天摄入超过 1000 毫克的 vitC 会致癌或致畸。 然而，高摄入量（> 1000-2000 毫克/天）可能导致腹泻和其他胃肠道紊乱，易感个体可能因草酸盐形成增加而形成肾结石。 由于 vitC 仅以生理剂量给药，预计该研究是安全的，不会给参与者带来额外风险；试点研究的经验支持的假设。