Epigenetica, vitamina C e formazione anormale delle cellule del sangue - Vitamina C nei pazienti con neoplasie mieloidi a basso rischio (EVITA)

SFONDO Recenti indagini hanno dimostrato che le mutazioni nei regolatori epigenetici sono comuni, sia nell'emopoiesi apparentemente normale degli anziani che nei pazienti (pts) con tumori mieloidi. Era da tempo previsto che la metilazione del DNA fosse un segno di silenziamento permanente, ma con la scoperta dei dieci undici enzimi di traslocazione (TET) è diventato chiaro che si verifica la demetilazione attiva. Le fasi iniziali di questo processo sono catalizzate dagli enzimi TET, che tuttavia sono frequentemente mutati e metilati nei tumori ematologici. Anche gli enzimi Jumonji, che catalizzano la demetilazione dell'istone, sono regolati in modo aberrante nei tumori ematologici.

La vitamina C (VitC) è stata identificata negli anni '30 come il micronutriente necessario nella prevenzione dello scorbuto. A differenza delle piante e della maggior parte degli animali, gli esseri umani non sono in grado di sintetizzare la vitC dal glucosio a causa della mancanza dell'enzima richiesto, la L-gulonolactone ossidasi. Pertanto, la vitC deve essere fornita attraverso la dieta. Studi recenti riconoscono la vitC come un importante cofattore per la famiglia Fe(II)- e 2-ossoglutarato diossigenasi. Questi includono gli enzimi TET, che sono coinvolti nella conversione della 5-metilcitosina (5-mC) nei suoi derivati ​​ossidati 5-idrossimetilcitosina (5-hmC), 5-carbossilcitosina (5-caC) e 5-formilcitosina (5-hmC). -fC) e gli enzimi Jumonji che sono coinvolti nella demetilazione dell'istone. Di conseguenza, vitC può potenzialmente svolgere un ruolo importante nella regolazione del DNA e della demetilazione dell'istone. Tuttavia, oltre l'80% dei pazienti con cancro ematologico è risultato essere gravemente carente di vitC. È interessante notare che le analisi di 20 partecipanti inclusi nello studio pilota randomizzato, controllato con placebo recentemente condotto dagli investigatori (NCT02877277) mostrano che il livello di vitC nei pazienti affetti da MDS e CMML sottoposti a trattamento con azacitidina, è facilmente elevato al range normale dall'integrazione orale di vitC (dati non pubblicati). Quando i pazienti che stavano già assumendo integratori di vitC sono passati al placebo, i livelli di vitC sono scesi rapidamente al di sotto del range normale.

È stato anche dimostrato che la formazione di 5-hmC e dei suoi derivati ​​può essere compromessa in individui sani e pazienti con mutazioni TET. Tuttavia, poiché molte di queste mutazioni sono eterozigoti e poiché i tre enzimi TET (TET1, TET2 e TET3) possono avere una certa ridondanza, il ripristino della vitC a livelli fisiologici potrebbe avere un impatto sul livello di 5-hmC/5-mC in individui con ematopoiesi clonale mutante TET o cancro ematologico.

Anche le analisi dei livelli di 5-hmC/5-mC nelle cellule mononucleate (MNC) del sangue periferico (PB) dei partecipanti allo studio pilota hanno mostrato una chiara tendenza verso l'aumento di 5-hmC nel braccio vitC, tuttavia, dopo aver progettato lo studio il i ricercatori si sono resi conto che i livelli di 5-hmC/5-mC sono meglio misurati nelle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo (BM), dove i livelli sono 10-20 volte superiori. Pertanto, lo studio pilota sarà seguito da uno studio randomizzato controllato con placebo di vitC orale in soggetti con neoplasie mieloidi a basso rischio; cioè, CCUS o MDS/CMML a basso rischio, per indagare se la vitC orale può modificare la biologia di queste entità patologiche e, in ultima analisi, prevenire la progressione.

Ipotesi:

1. I ricercatori e i collaboratori hanno precedentemente dimostrato che i malati di cancro sono carenti di vitC e anche gli individui con CCUS, che rappresenta la pre-MDS, potrebbero essere carenti di vitC. L'ipotesi è che ciò possa portare a livelli ridotti di 5-hmC/5-mC in vivo sia nei malati di cancro che negli individui con CCUS

2. L'innalzamento dei livelli sierici di vitC al range normale nei pazienti affetti da CCUS e MDS/CMML a basso rischio mediante supplementazione orale con vitC può

   • ridurre il clone maligno,
   • aumentare il rapporto 5-hmC/5-mC,
   • modificare il profilo delle citochine plasmatiche verso un profilo meno infiammatorio e meno cancerogeno,
   • modificare l'espressione genica

Obiettivi:

Per determinare se il ripristino della vitC al range normale nei pazienti CCUS e MDS/CMML a basso rischio può:

1. ridurre il clone maligno,
2. aumentare il rapporto 5-hmC/5-mC nei pazienti con CCUS e MDS/CMML a basso rischio
3. ridurre l'accumulo di 5-mC nei promotori/potenziatori/ripetizioni terminali lunghe (LTR) o in altre regioni genomiche regolatrici di soppressori tumorali/geni driver metilati/geni coinvolti nello sviluppo ematopoietico,
4. sovraregolare l'espressione di questi geni,
5. modificare il profilo delle citochine plasmatiche,
6. alterare la permeabilità intestinale (misurata dalla concentrazione di DNA batterico nel sangue periferico) e/o la composizione del microbiota intestinale,
7. comportare alcun rischio per la sicurezza.

PIANO DI RICERCA È previsto l'arruolamento di un totale di 100 pazienti. Gli individui con CCUS, MDS a basso rischio o CMML-0 o -1 saranno inclusi da Rigshospitalet, Herlev University Hospital, Odense University Hospital, Aalborg University Hospital o Keck Hospital of University of Southern California tra novembre 2017 e dicembre 2021.

I partecipanti entreranno nella randomizzazione a blocchi con un rapporto di 1:1; vitC 1000 mg/die p.o. rispetto al placebo per un anno.

È previsto l'arruolamento di un massimo di 30 volontari anziani sani. La quantità e il tipo di DNA batterico in PB saranno determinati e serviranno come controlli.

MATERIALE E MISURAZIONI PB: I campioni di PB (45 mL) saranno prelevati all'ingresso nello studio e ogni 3 mesi (o più se richiesto in base alla scelta del medico) durante il primo anno.

Le misurazioni includono conta ematica compreso conteggio differenziale, livelli di acido folico, vitamina B12, vitamina D, ferro, ferritina, transferrina, saturazione della transferrina, livelli plasmatici di vitC, citochine e contenuto di DNA batterico (riferito al DNA batterico sulla pelle del paziente e nelle feci) .

BM: i campioni di BM (18 mL) verranno prelevati all'ingresso nello studio, dopo 3 mesi e dopo un anno.

Saranno misurati i livelli di vitC e varie citochine. Le mutazioni nei geni frequentemente coinvolti nel cancro mieloide/ematopoiesi clonale, compresi i regolatori epigenetici, e le frequenze alleliche varianti (VAF) saranno studiate mediante sequenziamento mirato di nuova generazione in cellule BM CD34+ selezionate (se disponibili) o frazione BM negativa di CD34+ sorting all'ingresso nello studio , dopo 3 mesi e dopo un anno.

Il sequenziamento dell'RNA e la valutazione totale di 5-hmC/5-mC saranno eseguiti su cellule staminali ematopoietiche BM CD34+.

Feci: campioni di feci (9 ml) saranno raccolti da un sottogruppo di pazienti all'ingresso nello studio, dopo 3 mesi e dopo un anno. Il DNA batterico sarà estratto e sequenziato.

BIOBANCA DI RICERCA Presso l'Epi-/Genome Laboratory, Rigshospitalet/Biotech Research and Innovation Center sarà istituita una biobanca di ricerca per conservare i campioni biologici dei partecipanti. La biobanca di ricerca è approvata dal Regional Science Ethics Committee e dall'Agenzia danese per la protezione dei dati in conformità con la legge sul trattamento dei dati personali (licenza n. H-16022249 e 04864/RH-2016-259, rispettivamente). Le MNC separate crioconservate da BM e PB saranno conservate in aggiunta ai pellet di granulociti e al plasma. La data di chiusura della biobanca di ricerca è il 31-12-2030.

Per gli studi correlativi, i campioni biologici saranno inviati al Van Andel Research Institute, Grand Rapids, Stati Uniti, e all'Imperial College, Londra, Regno Unito (collaboratori esterni), rispettivamente per il sequenziamento dell'RNA e le analisi della metilazione e dell'idrossimetilazione del DNA. Campioni biologici saranno inviati anche alla Life Science Faculty, Università di Copenhagen, e al National Veterinary Institute, Technical University of Denmark (collaboratori esterni) per la misurazione delle concentrazioni sieriche di vitC e l'analisi delle risposte delle cellule T, rispettivamente.

METODI Misura della VitC: Ascorbato e vitC totale, cioè ascorbato + acido deidroascorbico (la forma ossidata di vitC; DHA), sono quantificati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) con rilevamento coulometrico; Il DHA viene valutato sottraendo l'ascorbato dal vitC totale. L'acido urico è usato come standard interno endogeno.

Ordinamento cellulare: ordinamento cellulare attivato magneticamente (MACS, utilizzando un dispositivo EasySep).

Misurazione totale di 5-hmC/5-mC: analisi dot blot di 5-hmC. Misurazione di 5-hmC/5-mC mediante spettrometria di massa.

Misurazione locus specifica 5-hmC/5-mC: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC in siti selezionati saranno misurati mediante pirosequenziamento.

Espressione genica: sequenziamento dell'RNA totale e reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversa.

Rilevamento delle mutazioni: sequenziamento mirato di nuova generazione di un pannello di geni mutati in modo ricorrente nel cancro mieloide come descritto.

CONSIDERAZIONI STATISTICHE E CALCOLO DELLA POTENZA Questo studio è il primo ad esaminare gli effetti della vitC in monoterapia sui livelli di 5-hmC/5-mC nelle cellule staminali ematopoietiche nell'uomo in vivo. Pertanto, non è possibile eseguire un calcolo della potenza o un calcolo della dimensione del campione. Il numero di partecipanti (n=100) è impostato come stima del numero necessario per osservare una potenziale differenza significativa tra i gruppi (vitC vs. placebo) nell'endpoint primario; variazione mediana della VAF delle mutazioni somatiche dal basale a 12 mesi.

Le analisi di efficacia sono per intenzione al trattamento. Le analisi di sicurezza includono tutti i partecipanti che ricevono almeno una dose della terapia protocollare.

CONSIDERAZIONI ETICHE Lo studio è stato approvato dal Regional Science Ethics Committee (H-16022249) e dall'Agenzia danese per la protezione dei dati (04864/RH-2016-259).

Tutti i partecipanti inclusi nel progetto saranno informati oralmente e per iscritto. La partecipazione sarà accettata solo dopo il consenso scritto. I partecipanti saranno informati che possono in qualsiasi momento e per qualsiasi motivo ritirarsi dallo studio senza che ciò influisca sul loro trattamento nel sistema sanitario.

Utilizzando l'approccio di sequenziamento del DNA mirato descritto, esiste un piccolo rischio di rilevare una mutazione germinale nei partecipanti correlata alla neoplasia mieloide. Ai partecipanti verrà chiesto di dichiarare nel consenso informato se non desiderano ricevere ulteriori informazioni rilevanti relative alla salute che potrebbero apparire durante le analisi del progetto. A meno che il partecipante non dichiari esplicitamente di non voler essere informato di eventuali potenziali risultati casuali relativi alla salute nello studio, il partecipante verrà informato e gli verranno offerte ulteriori indagini e consulenza genetica presso l'ospedale locale in caso di risultati casuali.

Svantaggi per il paziente, effetti collaterali, rischi e complicanze Il prelievo di sangue è associato a breve disagio e/o dolore. Nessun rischio significativo è associato al prelievo di sangue. Può verificarsi sanguinamento locale, che in rari casi può causare disagio e scolorimento per alcuni giorni. Raramente, un prelievo di sangue può causare una reazione vasovagale che porta a una breve perdita di coscienza.

L'aspirazione del midollo osseo è associata a un breve dolore mentre viene somministrata l'anestesia locale. Inoltre, molte persone avvertono una sensazione di disagio nelle natiche e nella gamba mentre il midollo osseo viene aspirato. Questo dura circa 30 secondi. Infine, per alcuni giorni dopo la procedura può verificarsi una certa tenerezza. Possibili complicazioni per sottoporsi a un'indagine BM includono sanguinamento e infezione. Tuttavia, l'incidenza di queste complicanze è estremamente bassa.

Secondo le Raccomandazioni Nordic Nutrition non ci sono prove che l'assunzione di vitC superiore a 1000 mg/giorno sia cancerogena o teratogena. Tuttavia, assunzioni elevate (> 1000-2000 mg/giorno) possono causare diarrea e altri disturbi gastrointestinali e gli individui predisposti possono sperimentare la formazione di calcoli renali a causa dell'aumento della formazione di ossalato. Poiché la vitC viene somministrata solo a dosi fisiologiche, si prevede che lo studio sia sicuro e non fornisca alcun rischio aggiuntivo per i partecipanti; un presupposto supportato dall'esperienza dello studio pilota.