Epigenetik, Vitamin C und abnormale Blutkörperchenbildung – Vitamin C bei Patienten mit myeloischen Malignomen mit geringem Risiko (EVITA)

HINTERGRUND Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass Mutationen in epigenetischen Regulatoren häufig sind, sowohl bei der scheinbar normalen Hämatopoese älterer Menschen als auch bei Patienten (PTs) mit myeloischen Krebsarten. Es wurde lange erwartet, dass die DNA-Methylierung ein permanentes Silencing-Zeichen ist, aber mit der Entdeckung der zehn elf Translokationsenzyme (TET) wurde klar, dass eine aktive Demethylierung stattfindet. Die ersten Schritte in diesem Prozess werden durch TET-Enzyme katalysiert, die jedoch bei hämatologischen Krebserkrankungen häufig mutiert und methyliert sind. Die Jumonji-Enzyme, die die Histon-Demethylierung katalysieren, werden auch bei hämatologischen Krebserkrankungen abweichend reguliert.

Vitamin C (VitC) wurde in den 1930er Jahren als notwendiger Mikronährstoff zur Vorbeugung von Skorbut identifiziert. Im Gegensatz zu Pflanzen und den meisten Tieren ist der Mensch nicht in der Lage, VitC aus Glukose zu synthetisieren, da ihm das erforderliche Enzym L-Gulonolacton-Oxidase fehlt. Daher muss VitC über die Nahrung zugeführt werden. Neuere Studien erkennen vitC als wichtigen Cofaktor für die Familie der Fe(II)- und 2-Oxoglutarat-Dioxygenasen an. Dazu gehören die TET-Enzyme, die an der Umwandlung von 5-Methylcytosin (5-mC) in seine oxidierten Derivate 5-Hydroxymethylcytosin (5-hmC), 5-Carboxylcytosin (5-caC) und 5-Formylcytosin (5 -fC) und die Jumonji-Enzyme, die an der Histon-Demethylierung beteiligt sind. Dementsprechend kann vitC möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Regulation von DNA und der Histon-Demethylierung spielen. Es wurde jedoch festgestellt, dass > 80 Prozent der hämatologischen Krebspatienten einen schweren VitC-Mangel aufwiesen. Interessanterweise zeigen Analysen von 20 Teilnehmern der kürzlich von den Prüfärzten durchgeführten randomisierten, placebokontrollierten Pilotstudie (NCT02877277), dass der VitC-Spiegel bei MDS- und CMML-Patienten, die sich einer Behandlung mit Azacitidin unterziehen, durch eine orale VitC-Ergänzung leicht auf den normalen Bereich angehoben werden kann (unveröffentlichte Daten). Als Patienten, die bereits VitC-Ergänzungen einnahmen, auf Placebo umgestellt wurden, fielen die VitC-Werte schnell unter den normalen Bereich.

Es wurde auch gezeigt, dass die Bildung von 5-hmC und seinen Derivaten bei gesunden Personen und Patienten mit TET-Mutationen beeinträchtigt sein kann. Da jedoch viele dieser Mutationen heterozygot sind und da die drei TET-Enzyme (TET1, TET2 und TET3) eine gewisse Redundanz aufweisen können, könnte die Wiederherstellung von vitC auf physiologische Niveaus einen Einfluss auf das Niveau von 5-hmC/5-mC haben bei Personen mit klonaler Hämatopoese mit TET-Mutation oder hämatologischem Krebs.

Analysen der 5-hmC/5-mC-Spiegel in mononukleären Zellen (MNCs) des peripheren Bluts (PB) der Teilnehmer an der Pilotstudie zeigten jedoch nach dem Design der Studie ebenfalls einen klaren Trend zu einem Anstieg von 5-hmC im VitC-Arm Die Forscher stellten fest, dass die 5-hmC/5-mC-Spiegel besser in hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark (BM) gemessen werden, wo die Spiegel 10-20-mal höher sind. Daher wird die Pilotstudie mit einer randomisierten placebokontrollierten Studie mit oralem VitC bei Personen mit myeloischen Malignomen mit geringem Risiko fortgesetzt; d.h. CCUS oder MDS/CMML mit niedrigem Risiko, um zu untersuchen, ob orales VitC die Biologie dieser Krankheitsentitäten verändern und letztendlich das Fortschreiten verhindern kann.

Hypothesen:

1. Die Forscher und Mitarbeiter haben zuvor gezeigt, dass Krebspatienten einen VitC-Mangel haben, und Personen mit CCUS, was Prä-MDS darstellt, könnten ebenfalls einen VitC-Mangel haben. Die Hypothese ist, dass dies sowohl bei Krebspatienten als auch bei Personen mit CCUS zu verringerten 5-hmC/5-mC-Spiegeln in vivo führen kann

2. Die Anhebung der VitC-Serumspiegel auf den normalen Bereich bei CCUS- und MDS/CMML-Patienten mit niedrigem Risiko durch orale Supplementierung mit VitC kann

   • den bösartigen Klon reduzieren,
   • das 5-hmC/5-mC-Verhältnis erhöhen,
   • Veränderung des Zytokinprofils im Plasma hin zu einem weniger entzündlichen, weniger tumorigenen Profil,
   • Genexpression verändern

Ziele:

Um zu bestimmen, ob die Wiederherstellung von vitC auf den normalen Bereich bei CCUS- und MDS/CMML-Patienten mit niedrigem Risiko Folgendes bewirken kann:

1. den bösartigen Klon reduzieren,
2. Erhöhen Sie das 5-hmC/5-mC-Verhältnis bei CCUS- und MDS/CMML-Patienten mit niedrigem Risiko
3. die Akkumulation von 5-mC an Promotoren/Enhancern/Long Terminal Repeats (LTRs) oder an anderen regulatorischen Genomregionen von Tumorsuppressoren/methylierten Treibergenen/Genen, die an der hämatopoetischen Entwicklung beteiligt sind, zu reduzieren,
4. die Expression dieser Gene hochregulieren,
5. das Plasmazytokinprofil verändern,
6. die Darmpermeabilität (gemessen anhand der Konzentration bakterieller DNA im peripheren Blut) und/oder die Zusammensetzung der Darmmikrobiota verändern,
7. keine Sicherheitsrisiken bergen.

FORSCHUNGSPLAN Es ist geplant, insgesamt 100 Patienten aufzunehmen. Personen mit CCUS, Niedrigrisiko-MDS oder CMML-0 oder -1 werden zwischen November 2017 und Dezember 2021 vom Rigshospitalet, Herlev University Hospital, Odense University Hospital, Aalborg University Hospital oder Keck Hospital of University of Southern California aufgenommen.

Die Teilnehmer werden in eine Block-Randomisierung mit einem Verhältnis von 1:1 eintreten; VitC 1000 mg/Tag p.o. gegenüber Placebo für ein Jahr.

Die Aufnahme von bis zu 30 gesunden älteren Freiwilligen ist geplant. Menge und Art der bakteriellen DNA in PB werden bestimmt und dienen als Kontrollen.

MATERIAL UND MESSUNGEN PB: PB-Proben (45 ml) werden zu Beginn der Studie und alle 3 Monate (oder mehr, falls erforderlich nach Wahl des Arztes) während des ersten Jahres entnommen.

Zu den Messungen gehören Blutbilder, einschließlich Differenzialzählung, Folsäurespiegel, Vitamin B12, Vitamin D, Eisen, Ferritin, Transferrin, Transferrinsättigung, Plasma-VitC-Spiegel, Zytokine und bakterieller DNA-Gehalt (bezogen auf bakterielle DNA auf der Haut des Patienten und im Stuhl) .

BM: BM-Proben (18 ml) werden bei Studieneintritt, nach 3 Monaten und nach einem Jahr entnommen.

Der VitC-Spiegel und verschiedene Zytokine werden gemessen. Mutationen in Genen, die häufig an myeloischem Krebs/klonaler Hämatopoese beteiligt sind, einschließlich epigenetischer Regulatoren, und variante Allelfrequenzen (VAF) werden durch gezielte Sequenzierung der nächsten Generation in sortierten BM-CD34+-Zellen (falls verfügbar) oder BM-negativer Fraktion von CD34+-Sortierung bei Studieneintritt untersucht , nach 3 Monaten und nach einem Jahr.

Die RNA-Sequenzierung und die Gesamtbewertung von 5-hmC/5-mC werden an hämatopoetischen CD34+-Stammzellen des Knochenmarks durchgeführt.

Kot: Kotproben (9 ml) werden von einer Untergruppe von Patienten bei Studieneintritt, nach 3 Monaten und nach einem Jahr gesammelt. Bakterien-DNA wird extrahiert und sequenziert.

FORSCHUNGSBIOBANK Eine Forschungsbiobank wird im Epi-/Genome Laboratory, Rigshospitalet / Biotech Research and Innovation Center eingerichtet, um die biologischen Proben der Teilnehmer zu lagern. Die Forschungsbiobank ist von der regionalen Wissenschaftsethikkommission und der dänischen Datenschutzbehörde gemäß dem Gesetz über die Verarbeitung personenbezogener Daten (Lizenz-Nr. H-16022249 bzw. 04864/RH-2016-259). Kryokonservierte abgetrennte MNCs aus BM und PB werden zusätzlich zu Granulozytenpellets und Plasma gelagert. Das Datum für die Schließung der Forschungsbiobank ist der 31.12.2030.

Für korrelative Studien werden biologische Proben an das Van Andel Research Institute, Grand Rapids, USA, und das Imperial College, London, UK (externe Mitarbeiter) zur RNA-Sequenzierung und Analyse der DNA-Methylierung bzw. Hydroxymethylierung geschickt. Biologische Proben werden auch an die Life Science Faculty der Universität Kopenhagen und das Nationale Veterinärinstitut der Technischen Universität Dänemark (externe Mitarbeiter) zur Messung der Serum-vitC-Konzentrationen bzw. zur Analyse der T-Zell-Antworten geschickt.

METHODEN VitC-Messung: Ascorbat und Gesamt-VitC, d. h. Ascorbat + Dehydroascorbinsäure (die oxidierte Form von VitC; DHA), werden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit coulometrischer Detektion quantifiziert; DHA wird durch Subtraktion von Ascorbat vom Gesamt-vitC bestimmt. Als körpereigener interner Standard wird Harnsäure verwendet.

Zellsortierung: Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS, unter Verwendung eines EasySep-Geräts).

Gesamt-5-hmC/5-mC-Messung: Dot-Blot-Analyse von 5-hmC. 5-hmC/5-mC-Messung durch Massenspektrometrie.

Locus-spezifische 5-hmC/5-mC-Messung: „EPIC“ 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC wird an ausgewählten Stellen durch Pyrosequenzierung gemessen.

Genexpression: Gesamt-RNA-Sequenzierung und reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion.

Mutationserkennung: Gezielte Next-Generation-Sequenzierung einer Reihe von Genen, die wie beschrieben bei myeloischem Krebs wiederholt mutiert sind.

STATISTISCHE ÜBERLEGUNGEN UND LEISTUNGSBERECHNUNG Diese Studie ist die erste Studie, die die Auswirkungen von VitC als Monotherapie auf die 5-hmC/5-mC-Spiegel in hämatopoetischen Stammzellen beim Menschen in vivo untersucht. Daher ist es nicht möglich, eine Power-Berechnung oder eine Stichprobenumfangsberechnung durchzuführen. Die Anzahl der Teilnehmer (n = 100) wird als Schätzung der Anzahl festgelegt, die erforderlich ist, um einen potenziell signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (vitC vs. Placebo) beim primären Endpunkt zu beobachten; Mediane Veränderung der VAF von somatischen Mutationen von der Baseline bis zu 12 Monaten.

Wirksamkeitsanalysen erfolgen nach Intention-to-treat. Sicherheitsanalysen umfassen alle Teilnehmer, die mindestens eine Dosis der Protokolltherapie erhalten.

ETHISCHE ÜBERLEGUNGEN Die Studie wurde von der regionalen Wissenschaftsethikkommission (H-16022249) und der dänischen Datenschutzbehörde (04864/RH-2016-259) genehmigt.

Alle Projektbeteiligten werden mündlich und schriftlich informiert. Die Teilnahme wird nur nach schriftlicher Zustimmung akzeptiert. Die Teilnehmer werden darüber informiert, dass sie jederzeit aus beliebigen Gründen von der Studie zurücktreten können, ohne dass dies Auswirkungen auf ihre Behandlung im Gesundheitssystem hat.

Unter Verwendung des beschriebenen gezielten DNA-Sequenzierungsansatzes besteht ein geringes Risiko, dass bei den Teilnehmern eine Keimbahnmutation im Zusammenhang mit myeloischer Malignität entdeckt wird. Die Teilnehmer werden gebeten, in der Einverständniserklärung anzugeben, ob sie keine weiteren relevanten gesundheitsbezogenen Informationen erhalten möchten, die während der Projektanalysen auftreten können. Sofern der Teilnehmer nicht ausdrücklich erklärt, dass er nicht über mögliche gesundheitsbezogene Zufallsbefunde der Studie informiert werden möchte, wird der Teilnehmer informiert und bei Zufallsbefunden weitere Untersuchungen und genetische Beratung im örtlichen Krankenhaus angeboten.

Patientennachteile, Nebenwirkungen, Risiken und Komplikationen Die Blutentnahme ist mit kurzzeitigen Beschwerden und/oder Schmerzen verbunden. Mit der Blutentnahme sind keine wesentlichen Risiken verbunden. Es kann zu lokalen Blutungen kommen, die in seltenen Fällen für einige Tage zu Beschwerden und Verfärbungen führen können. Selten kann eine Blutentnahme eine vasovagale Reaktion hervorrufen, die zu einem kurzzeitigen Bewusstseinsverlust führt.

Die KM-Aspiration ist während der Lokalanästhesie mit kurzen Schmerzen verbunden. Darüber hinaus erleben viele Personen ein unangenehmes Gefühl in den Nasenflügeln und Beinen, während der KM aspiriert wird. Dies dauert ungefähr 30 Sekunden. Schließlich kann einige Tage nach dem Eingriff eine gewisse Zärtlichkeit auftreten. Mögliche Komplikationen bei einer BM-Untersuchung sind Blutungen und Infektionen. Die Inzidenz dieser Komplikationen ist jedoch äußerst gering.

Gemäß den nordischen Ernährungsempfehlungen gibt es keine Hinweise darauf, dass eine Aufnahme von VitC über 1000 mg/Tag entweder krebserregend oder teratogen ist. Eine hohe Aufnahme (> 1000-2000 mg/Tag) kann jedoch Durchfall und andere Magen-Darm-Störungen verursachen, und bei empfindlichen Personen kann es aufgrund einer erhöhten Oxalatbildung zu einer Nierensteinbildung kommen. Da vitC nur in physiologischen Dosen verabreicht wird, ist davon auszugehen, dass die Studie sicher ist und kein zusätzliches Risiko für die Teilnehmer darstellt; eine Annahme, die durch die Erfahrungen aus der Pilotstudie gestützt wird.