Epigenetik, C-vitamin og unormal blodcelledannelse - C-vitamin hos patienter med lavrisiko-myeloid malignitet (EVITA)

BAGGRUND Nylige undersøgelser har vist, at mutationer i epigenetiske regulatorer er almindelige, både i den tilsyneladende normale hæmatopoiese hos ældre og hos patienter (pts) med myeloid cancer. Det var længe forventet, at DNA-methylering var et permanent dæmpningsmærke, men med opdagelsen af ​​de ti elleve translokationsenzymer (TET) blev det klart, at aktiv demethylering forekommer. De indledende trin i denne proces katalyseres af TET-enzymer, som dog hyppigt muteres og methyleres i hæmatologiske kræftformer. Jumonji-enzymerne, som katalyserer histon-demethylering, er også afvigende reguleret i hæmatologiske kræftformer.

Vitamin C (VitC) blev identificeret i 1930'erne som det nødvendige mikronæringsstof til forebyggelse af skørbug. I modsætning til planter og de fleste dyr er mennesker ude af stand til at syntetisere vitC fra glucose på grund af mangel på det nødvendige enzym, L-gulonolactonoxidase. Derfor skal vitC tilføres gennem kosten. Nylige undersøgelser anerkender vitC som en vigtig cofaktor for Fe(II)- og 2-oxoglutaratdioxygenasefamilien. Disse omfatter TET-enzymer, som er involveret i omdannelsen af ​​5-methylcytosin (5-mC) til dets oxiderede derivater 5-hydroxymethylcytosin (5-hmC), 5-carboxylcytosin (5-caC) og 5-formylcytosin (5) -fC), og Jumonji-enzymer, der er involveret i histon-demethylering. Derfor kan vitC potentielt spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​DNA og histon demethylering. Imidlertid viste > 80 procent af hæmatologiske cancerpkter sig at være alvorligt vitC-mangel. Interessant nok viser analyser af 20 deltagere inkluderet i efterforskernes nyligt udførte randomiserede, placebokontrollerede pilotundersøgelse (NCT02877277), at niveauet af vitC i MDS og CMML pts, der gennemgår behandling med azacitidin, let hæves til normalområdet ved oralt vitC-tilskud. (upublicerede data). Når pts, der allerede tog vitC-tilskud, blev skiftet til placebo, faldt vitC-niveauerne hurtigt under det normale område.

Det er også blevet vist, at dannelsen af ​​5-hmC og dets derivater kan være kompromitteret hos raske individer og pts med TET-mutationer. Men da mange af disse mutationer er heterozygote, og da de tre TET-enzymer (TET1, TET2 og TET3) kan have en vis redundans, kan genoprettelse af vitC til fysiologiske niveauer have en indvirkning på niveauet af 5-hmC/5-mC hos personer med TET-mutant klonal hæmatopoiesis eller hæmatologisk cancer.

Analyser af 5-hmC/5-mC-niveauer i perifere blod (PB) mononukleære celler (MNC'er) fra deltagerne i pilotstudiet viste også en klar tendens til øget 5-hmC i vitC-armen, men efter udformningen af ​​forsøget forskere indså, at 5-hmC/5-mC-niveauer er bedre målt i hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven (BM), hvor niveauerne er 10-20 gange højere. Pilotstudiet vil således blive fulgt op med et randomiseret placebokontrolleret forsøg med oral vitC hos personer med lavrisiko myeloid malignitet; dvs. CCUS eller lavrisiko MDS/CMML for at undersøge, om oral vitC kan ændre biologien af ​​disse sygdomsenheder og i sidste ende forhindre progression.

Hypoteser:

1. Efterforskerne og samarbejdspartnerne har tidligere vist, at kræftpkter er vitC-mangelfulde, og personer med CCUS, som repræsenterer præ-MDS, kan også være vitC-mangelfulde. Hypotesen er, at dette kan føre til reducerede niveauer af 5-hmC/5-mC in vivo i både kræftpatienter og personer med CCUS

2. Forhøjelse af serum vitC-niveauer til normalområdet i CCUS og lavrisiko MDS/CMML pts ved oralt tilskud med vitC kan

   • reducere den ondartede klon,
   • øge 5-hmC/5-mC-forholdet,
   • ændre plasmacytokinprofilen mod en mindre inflammatorisk, mindre tumorigen profil,
   • ændre genekspression

Mål:

For at afgøre, om genoprettelse af vitC til normalområdet i CCUS og lavrisiko MDS/CMML pts kan:

1. reducere den ondartede klon,
2. øge 5-hmC/5-mC-forholdet i CCUS og lavrisiko MDS/CMML pts
3. reducere akkumulering af 5-mC ved promotorer/forstærkere/lange terminale gentagelser (LTR'er) eller ved andre regulatoriske genomiske regioner af tumorsuppressorer/methylerede drivergener/gener involveret i hæmatopoietisk udvikling,
4. opregulere ekspressionen af ​​disse gener,
5. ændre plasmacytokinprofilen,
6. ændre intestinal permeabilitet (målt ved koncentration af bakterielt DNA i perifert blod) og/eller sammensætning af tarmmikrobiota,
7. medføre eventuelle sikkerhedsrisici.

FORSKNINGSPLAN I alt 100 patienter er planlagt til indskrivning. Personer med CCUS, lavrisiko MDS eller CMML-0 eller -1 vil blive inkluderet fra Rigshospitalet, Herlev Universitetshospital, Odense Universitetshospital, Aalborg Universitetshospital eller Keck Hospital of University of Southern California mellem november 2017-december 2021.

Deltagerne vil gå ind i blokrandomisering med et forhold på 1:1; vitC 1000 mg/dag p.o. versus placebo i et år.

Op til 30 raske ældre frivillige er planlagt til tilmelding. Mængde og type af bakterielt DNA i PB vil blive bestemt og tjene som kontroller.

MATERIALE OG MÅLINGER PB: PB-prøver (45 ml) vil blive taget ved studiestart og hver 3. måned (eller mere, hvis det kræves i henhold til lægens valg) i løbet af det første år.

Målinger omfatter blodtal, herunder differentialtælling, niveauer af folinsyre, vitamin B12, vitamin D, jern, ferritin, transferrin, transferrinmætning, plasma vitC-niveauer, cytokiner og bakterielt DNA-indhold (refereret til bakterielt DNA på patientens hud og i fæces) .

BM: BM-prøver (18 ml) vil blive taget ved studiestart, efter 3 måneder og efter et år.

Niveauer af vitC og forskellige cytokiner vil blive målt. Mutationer i gener, der ofte er involveret i myeloid cancer/klonal hæmatopoiesis, inklusive epigenetiske regulatorer, og variant allel frekvenser (VAF) vil blive undersøgt ved målrettet næste generations sekventering i sorterede BM CD34+ celler (hvis tilgængelig) eller BM negativ fraktion af CD34+ sortering ved undersøgelsens start , efter 3 måneder og efter et år.

RNA-sekventering og total 5-hmC/5-mC vurdering vil blive udført på BM CD34+ hæmatopoietiske stamceller.

Afføring: Afføringsprøver (9 mL) vil blive indsamlet fra en undergruppe af patienter ved studiestart, efter 3 måneder og efter et år. Bakterie-DNA vil blive ekstraheret og sekventeret.

FORSKNINGSBIOBANK Der etableres en forskningsbiobank på Epi-/Genomlaboratoriet, Rigshospitalet/Biotek Forsknings- og Innovationscenter til at opbevare de biologiske prøver fra deltagerne. Forskningsbiobanken er godkendt af Den Regionale Videnskabsetiske Komité og Datatilsynet i henhold til lov om behandling af personoplysninger (licensnr. henholdsvis H-16022249 og 04864/RH-2016-259). Kryokonserverede adskilte MNC'er fra BM og PB vil blive opbevaret ud over granulocytpellets og plasma. Datoen for lukning af forskningsbiobanken er 31-12-2030.

For korrelative undersøgelser vil biologiske prøver blive sendt til Van Andel Research Institute, Grand Rapids, USA, og Imperial College, London, UK (eksterne samarbejdspartnere), til RNA-sekventering og analyser af henholdsvis DNA-methylering og hydroxymethylering. Biologiske prøver vil også blive sendt til Life Science Fakultet, Københavns Universitet og DTU, Danmarks Tekniske Universitet (eksterne samarbejdspartnere) til henholdsvis måling af serum vitC-koncentrationer og analyser af T-celle-responser.

METODER VitC-måling: Ascorbat og total vitC, dvs. ascorbat + dehydroascorbinsyre (den oxiderede form af vitC; DHA), kvantificeres ved højtydende væskekromatografi (HPLC) med coulometrisk detektion; DHA vurderes ved subtraktion af ascorbat fra total vitC. Urinsyre bruges som endogen intern standard.

Cellesortering: Magnetisk aktiveret cellesortering (MACS, ved hjælp af en EasySep-enhed).

Total 5-hmC/5-mC-måling: Dot blot-analyse af 5-hmC. 5-hmC/5-mC måling ved massespektrometri.

Locus-specifik 5-hmC/5-mC-måling: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC på udvalgte steder vil blive målt ved pyrosequencing.

Genekspression: Total RNA-sekventering og omvendt transkriptase-kvantitativ polymerasekædereaktion.

Mutationsdetektion: Målrettet næste generations sekventering af et panel af gener, der gentagne gange er muteret i myeloid cancer som beskrevet.

STATISTISKE OVERVEJELSER OG KRAFTBEREGNING Denne undersøgelse er den første undersøgelse, der undersøger virkningerne af vitC som monoterapi på 5-hmC/5-mC niveauer i hæmatopoietiske stamceller hos mennesker in vivo. Derfor er det ikke muligt at udføre en effektberegning eller en prøvestørrelsesberegning. Antallet af deltagere (n=100) er sat som et estimat af det antal, der er nødvendigt for at observere en potentiel signifikant forskel mellem grupperne (vitC vs. placebo) i det primære endepunkt; median ændring i VAF af somatiske mutationer fra baseline til 12 måneder.

Effektanalyser er ved intention-to-treat. Sikkerhedsanalyser omfatter alle deltagere, der modtager mindst én dosis protokolterapi.

ETISKE OVERVEJELSER Undersøgelsen er godkendt af Den Regionale Videnskabsetiske Komité (H-16022249) og Datatilsynet (04864/RH-2016-259).

Alle deltagere i projektet vil blive informeret mundtligt og skriftligt. Deltagelse accepteres kun efter skriftligt samtykke. Deltagerne vil blive informeret om, at de til enhver tid uanset årsag kan trække sig fra undersøgelsen, uden at det påvirker deres behandling i sundhedsvæsenet.

Ved at bruge den beskrevne målrettede DNA-sekventeringstilgang, er der en lille risiko for at påvise en kimlinjemutation hos deltagerne relateret til myeloid malignitet. Deltagerne vil blive bedt om at angive i det informerede samtykke, hvis de ikke ønsker at modtage yderligere relevante helbredsrelaterede oplysninger, der måtte fremkomme under projektanalyserne. Medmindre deltageren udtrykkeligt angiver, at han eller hun ikke ønsker at blive informeret om eventuelle helbredsrelaterede tilfældige fund i undersøgelsen, vil deltageren blive informeret og tilbudt yderligere undersøgelser og genetisk rådgivning på det lokale hospital i tilfælde af tilfældige fund.

Patientulemper, bivirkninger, risici og komplikationer Blodprøvetagning er forbundet med kortvarigt ubehag og/eller smerte. Der er ingen væsentlige risici forbundet med blodprøvetagningen. Der kan opstå lokale blødninger, som i sjældne tilfælde kan give ubehag og misfarvning i nogle dage. I sjældne tilfælde kan en blodprøve forårsage vasovagal reaktion, der fører til et kortvarigt bevidsthedstab.

BM-aspiration er forbundet med kortvarige smerter, mens lokalbedøvelsen gives. Desuden oplever mange individer en ubehagelig følelse i fødderne og benet, mens BM aspireres. Dette varer cirka 30 sekunder. Endelig kan der opstå en vis ømhed i nogle dage efter indgrebet. Mulige komplikationer til at gennemgå en BM-undersøgelse omfatter blødning og infektion. Imidlertid er forekomsten af ​​disse komplikationer ekstremt lav.

Ifølge de nordiske ernæringsanbefalinger er der ingen evidens for, at indtag af vitC over 1000 mg/dag er hverken kræftfremkaldende eller teratogent. Højt indtag (> 1000-2000 mg/dag) kan dog forårsage diarré og andre mave-tarmforstyrrelser, og modtagelige personer kan opleve nyrestensdannelse fra øget oxalatdannelse. Da vitC kun gives i fysiologiske doser, forventes det, at undersøgelsen er sikker og ikke vil give nogen yderligere risiko for deltagerne; en antagelse, der understøttes af erfaringerne fra pilotundersøgelsen.