Epigenetiikka, C-vitamiini ja epänormaali verisolujen muodostus - C-vitamiini potilailla, joilla on matalariskinen myeloidisyöpä (EVITA)

TAUSTA Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatiot epigeneettisissä säätelijöissä ovat yleisiä sekä näennäisesti normaalissa vanhusten hematopoieesissa että potilailla (pts), joilla on myeloidisyöpä. Pitkään odotettiin, että DNA:n metylaatio oli pysyvä hiljennysmerkki, mutta kymmenen yhdentoista translokaatioentsyymin (TET) löytämisen myötä kävi selväksi, että aktiivista demetylaatiota tapahtuu. Tämän prosessin alkuvaiheita katalysoivat TET-entsyymit, jotka kuitenkin usein mutatoituvat ja metyloituvat hematologisissa syövissä. Jumonji-entsyymit, jotka katalysoivat histonin demetylaatiota, ovat myös poikkeavasti säädeltyjä hematologisissa syövissä.

C-vitamiini (VitC) tunnistettiin 1930-luvulla välttämättömäksi hivenaineeksi keripukin ehkäisyssä. Toisin kuin kasvit ja useimmat eläimet, ihmiset eivät pysty syntetisoimaan vitC:tä glukoosista tarvittavan entsyymin, L-gulonolaktonioksidaasin, puutteen vuoksi. Siksi vitC on saatava ruokavalion kautta. Viimeaikaiset tutkimukset tunnustavat vitC:n tärkeäksi kofaktoriksi Fe(II)- ja 2-oksoglutaraattidioksigenaasiperheelle. Näitä ovat TET-entsyymit, jotka osallistuvat 5-metyylisytosiinin (5-mC) muuntamiseen sen hapettuneiksi johdannaisiksi 5-hydroksimetyylisytosiiniksi (5-hmC), 5-karboksyylisytosiiniksi (5-caC) ja 5-formyylisytosiiniksi (5). -fC) ja Jumonji-entsyymit, jotka osallistuvat histonin demetylaatioon. Näin ollen vitC:llä voi mahdollisesti olla tärkeä rooli DNA:n ja histonin demetylaation säätelyssä. Kuitenkin yli 80 prosentilla hematologisista syövistä havaittiin olevan vakava vitC-puutos. Mielenkiintoista on, että tutkijoiden äskettäin suorittamaan satunnaistettuun, lumekontrolloituun pilottitutkimukseen (NCT02877277) kuuluvien 20 osallistujan analyysit osoittavat, että atsasitidiinihoitoa saavien MDS- ja CMML-pts-potilaiden vitC-taso nousee helposti normaalille alueelle oraalisen vitC-lisän avulla. (julkaisemattomat tiedot). Kun jo vitC-lisäravinteita käyttäneet henkilöt vaihdettiin lumelääkkeeseen, vitC-tasot putosivat nopeasti normaalin alueen alapuolelle.

On myös osoitettu, että 5-hmC:n ja sen johdannaisten muodostuminen voi vaarantua terveillä yksilöillä ja pts:illä, joilla on TET-mutaatioita. Koska monet näistä mutaatioista ovat heterotsygoottisia ja koska kolmella TET-entsyymillä (TET1, TET2 ja TET3) voi olla redundanssia, vitC:n palautuminen fysiologisille tasoille saattaa vaikuttaa 5-hmC/5-mC-tasoon. yksilöillä, joilla on TET-mutanttiklonaalinen hematopoieesi tai hematologinen syöpä.

Pilottitutkimukseen osallistuneiden 5-hmC/5-mC-tasojen analyysit perifeerisen veren (PB) mononukleaarisissa soluissa (MNC:t) osoittivat myös selkeän suuntauksen 5-hmC:n nousuun vitC-haarassa, mutta tutkimuksen suunnittelun jälkeen tutkijat ymmärsivät, että 5-hmC/5-mC-tasot mitataan paremmin hematopoieettisissa kantasoluissa luuytimessä (BM), jossa tasot ovat 10-20 kertaa korkeammat. Näin ollen pilottitutkimusta seurataan satunnaistetulla lumekontrolloidulla tutkimuksella suun kautta annetusta vitC:stä henkilöillä, joilla on matalan riskin myeloidisia pahanlaatuisia kasvaimia; eli CCUS tai matalariskinen MDS/CMML, jotta voidaan tutkia, voiko oraalinen vitC muuttaa näiden sairauskokonaisuuksien biologiaa ja lopulta estää etenemisen.

Hypoteesit:

1. Tutkijat ja yhteistyökumppanit ovat aiemmin osoittaneet, että syöpäpotilailla on vitC-puutos, ja henkilöillä, joilla on CCUS, joka edustaa pre-MDS:ää, saattaa myös olla vitC-puutos. Oletuksena on, että tämä voi johtaa 5-hmC/5-mC:n alenemiseen in vivo sekä syöpäpotilailla että yksilöillä, joilla on CCUS.

2. Seerumin vitC-pitoisuuksien nostaminen normaalille alueelle CCUS:ssa ja matalariskisissä MDS/CMML-pisteissä oraalisella vitC-lisäyksellä voi

   • vähentää pahanlaatuista kloonia,
   • lisää 5-hmC/5-mC-suhdetta,
   • muuttaa plasman sytokiiniprofiilia kohti vähemmän tulehduksellista, vähemmän kasvaimia aiheuttavaa profiilia,
   • muuttaa geenin ilmentymistä

Tavoitteet:

Voit määrittää, voiko vitC:n palauttaminen normaalille alueelle CCUS:ssa ja vähäriskisissä MDS/CMML-pisteissä:

1. vähentää pahanlaatuista kloonia,
2. lisää 5-hmC/5-mC-suhdetta CCUS:ssa ja matalariskisissä MDS/CMML-pisteissä
3. vähentää 5-mC:n kerääntymistä promoottoreihin/tehostajiin/pitkiin terminaalisiin toistoihin (LTR) tai muihin tuumorisuppressoreiden/metyloituneiden kuljettajageenien/verien kehitykseen osallistuvien geenien genomialueisiin,
4. säätelee näiden geenien ilmentymistä,
5. muuttaa plasman sytokiiniprofiilia,
6. muuttaa suoliston läpäisevyyttä (mitataan bakteeri-DNA:n pitoisuudella ääreisveressä) ja/tai suoliston mikrobiston koostumusta,
7. aiheuttaa turvallisuusriskejä.

TUTKIMUSSUUNNITELMA Yhteensä 100 potilasta on suunniteltu otettavaksi. Henkilöt, joilla on CCUS, matalan riskin MDS tai CMML-0 tai -1, otetaan mukaan Rigshospitaletista, Herlevin yliopistollisesta sairaalasta, Odensen yliopistollisesta sairaalasta, Aalborgin yliopistollisesta sairaalasta tai Keckin sairaalasta Etelä-Kalifornian yliopistosta marraskuun 2017 ja joulukuun 2021 välisenä aikana.

Osallistujat siirtyvät lohkosatunnaistukseen suhteessa 1:1; vitC 1000 mg/vrk p.o. plaseboon verrattuna yhden vuoden ajan.

Ilmoittautumaan suunnitellaan jopa 30 tervettä iäkästä vapaaehtoista. Bakteeri-DNA:n määrä ja tyyppi PB:ssä määritetään ja toimivat kontrolleina.

MATERIAALIT JA MITTAUKSET PB: PB-näytteet (45 ml) otetaan tutkimukseen tullessa ja 3 kuukauden välein (tai useammin, jos lääkärin valinnan mukaan) ensimmäisen vuoden aikana.

Mittaukset sisältävät veriarvot, mukaan lukien erittely, foolihappotasot, B12-vitamiini, D-vitamiini, rauta, ferritiini, transferriini, transferriini saturaatio, plasman vitC-tasot, sytokiinit ja bakteeri-DNA-pitoisuus (viitataan bakteeri-DNA:han potilaan iholla ja ulosteessa) .

BM: BM-näytteet (18 ml) otetaan tutkimukseen tullessa, 3 kuukauden kuluttua ja vuoden kuluttua.

VitC:n ja eri sytokiinien tasot mitataan. Mutaatioita geeneissä, jotka usein osallistuvat myelooiseen syöpään/klonaaliseen hematopoieesiin, mukaan lukien epigeneettiset säätelijät ja varianttialleelitaajuudet (VAF), tutkitaan kohdennetulla seuraavan sukupolven sekvensoinnilla lajitetuissa BM CD34+ -soluissa (jos saatavilla) tai CD34+-lajittelun BM-negatiivisessa fraktiossa tutkimukseen tullessa. , 3 kuukauden ja vuoden kuluttua.

RNA-sekvensointi ja kokonaisarvon 5-hmC/5-mC arviointi suoritetaan BM CD34+ -verenmuodostuksen kantasoluille.

Ulosteet: Ulostenäytteet (9 ml) kerätään osasta potilaista tutkimukseen tullessa, kolmen kuukauden ja vuoden kuluttua. Bakteeri-DNA uutetaan ja sekvensoidaan.

TUTKIMUKSEN BIOPANKKI Tutkimusbiopankki perustetaan The Epi-/Genome Laboratory, Rigshospitalet / Biotech Research and Innovation Centeriin osallistujien biologisten näytteiden tallentamiseksi. Tutkimusbiopankki on alueellisen tiedeeettisen toimikunnan ja Tanskan tietosuojaviraston hyväksymä henkilötietojen käsittelystä annetun lain mukaisesti (lisenssi nro. H-16022249 ja 04864/RH-2016-259). Kylmäsäilötyt erotetut MNC:t BM:stä ja PB:stä varastoidaan granulosyyttipellettien ja plasman lisäksi. Tutkimusbiopankin sulkemispäivä on 31.12.2030.

Korrelatiivisia tutkimuksia varten biologiset näytteet lähetetään Van Andel Research Institutelle, Grand Rapids, USA ja Imperial College, Lontoo, UK (ulkoiset yhteistyökumppanit) RNA-sekvensointia ja DNA-metylaation ja hydroksimetylaation analyyseja varten. Biologiset näytteet lähetetään myös Kööpenhaminan yliopiston biotieteiden tiedekunnalle ja Tanskan teknisen yliopiston kansalliselle eläinlääkintäinstituutille (ulkopuoliset yhteistyökumppanit) seerumin vitC-pitoisuuksien mittaamista ja T-soluvasteiden analyysejä varten.

MENETELMÄT VitC-mittaus: Askorbaatti ja kokonaisvitC, eli askorbaatti + dehydroaskorbiinihappo (vitC:n hapetettu muoto; DHA), kvantifioidaan korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) kulometrisellä detektiolla; DHA määritetään vähentämällä askorbaatti kokonaisvitC:stä. Virtsahappoa käytetään endogeenisenä sisäisenä standardina.

Solujen lajittelu: Magneettisesti aktivoitu solulajittelu (MACS, EasySep-laitteella).

5-hmC/5-mC kokonaismittaus: 5-hmC:n pisteblot-analyysi. 5-hmC/5-mC mittaus massaspektrometrialla.

Lokuskohtainen 5-hmC/5-mC-mittaus: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC valituissa kohdissa mitataan pyrosekvensoimalla.

Geeniekspressio: RNA:n kokonaissekvensointi ja käänteistranskriptaasi-kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio.

Mutaatioiden havaitseminen: Kohdennettu seuraavan sukupolven sekvensointi myeloidisessa syövässä toistuvasti mutatoituneiden geenien paneelille kuvatulla tavalla.

TILASTOTIEDOT JA TEHOLASKEMINEN Tämä tutkimus on ensimmäinen tutkimus, jossa tutkitaan vitC:n vaikutuksia monoterapiana 5-hmC/5-mC-tasoihin ihmisen hematopoieettisissa kantasoluissa in vivo. Siksi teholaskennan tai otoskoon laskentaa ei ole mahdollista suorittaa. Osallistujien lukumäärä (n = 100) on asetettu arvioksi määrästä, joka tarvitaan havaitsemaan mahdollinen merkittävä ero ryhmien välillä (vitC vs. lumelääke) ensisijaisessa päätepisteessä; somaattisten mutaatioiden VAF:n mediaanimuutos lähtötasosta 12 kuukauteen.

Tehoanalyysit tehdään hoitotarkoituksen mukaan. Turvallisuusanalyysit sisältävät kaikki osallistujat, jotka saavat vähintään yhden annoksen protokollahoitoa.

EETTISET NÄKÖKOHDAT Tutkimuksen ovat hyväksyneet alueellinen tiedeetiikkakomitea (H-16022249) ja Tanskan tietosuojavirasto (04864/RH-2016-259).

Kaikille hankkeeseen osallistuville tiedotetaan suullisesti ja kirjallisesti. Osallistuminen hyväksytään vasta kirjallisen suostumuksen jälkeen. Osallistujille ilmoitetaan, että he voivat milloin tahansa mistä tahansa syystä vetäytyä tutkimuksesta ilman, että se vaikuttaa heidän hoitoon terveydenhuoltojärjestelmässä.

Kuvattua kohdennettua DNA-sekvensointimenetelmää käytettäessä on pieni riski havaita myeloidiseen pahanlaatuisuuteen liittyvä ituradan mutaatio osallistujilla. Osallistujia pyydetään ilmoittamaan tietoon perustuvassa suostumuksessaan, jos he eivät halua saada muuta olennaista terveyteen liittyvää tietoa, joka saattaa ilmaantua hankkeen analyysien aikana. Ellei osallistuja nimenomaisesti ilmoita, että hän ei halua saada tietoa mahdollisista terveyteen liittyvistä satunnaislöydöksistä tutkimuksessa, osallistujalle tiedotetaan ja hänelle tarjotaan lisätutkimuksia ja geneettistä neuvontaa paikallisessa sairaalassa satunnaisten löydösten sattuessa.

Potilaan haitat, sivuvaikutukset, riskit ja komplikaatiot Verinäytteenottoon liittyy lyhytaikainen epämukavuus ja/tai kipu. Verinäytteenottoon ei liity merkittäviä riskejä. Paikallista verenvuotoa voi esiintyä, mikä harvoissa tapauksissa voi aiheuttaa epämukavuutta ja värimuutoksia muutaman päivän ajan. Harvoin verinäytteenotto voi aiheuttaa vasovagaalisen reaktion, joka johtaa lyhyeen tajunnan menetykseen.

BM-aspiraatioon liittyy lyhytaikainen kipu paikallispuudutuksen aikana. Lisäksi monet ihmiset kokevat epämiellyttävän tunteen selässä ja jalassa, kun keuhkolihasta imetään. Tämä kestää noin 30 sekuntia. Lopuksi, arkuutta voi esiintyä muutaman päivän ajan toimenpiteen jälkeen. BM-tutkimuksen mahdollisia komplikaatioita ovat verenvuoto ja infektio. Näiden komplikaatioiden ilmaantuvuus on kuitenkin erittäin alhainen.

Pohjoismaisten ravitsemussuositusten mukaan ei ole todisteita siitä, että yli 1000 mg/vrk vitC:n saanti olisi syöpää tai teratogeenista. Suuret annokset (> 1000-2000 mg/vrk) voivat kuitenkin aiheuttaa ripulia ja muita ruoansulatuskanavan häiriöitä, ja herkillä yksilöillä voi ilmetä munuaiskivien muodostumista lisääntyneen oksalaattimuodostuksen seurauksena. Koska vitC:tä annetaan vain fysiologisina annoksina, tutkimuksen odotetaan olevan turvallinen eikä aiheuta lisäriskiä osallistujille; oletus, jota pilottitutkimuksesta saadut kokemukset tukevat.