Epigenética, vitamina C y formación anormal de células sanguíneas: vitamina C en pacientes con neoplasias malignas mieloides de bajo riesgo (EVITA)

ANTECEDENTES Investigaciones recientes han demostrado que las mutaciones en los reguladores epigenéticos son comunes, tanto en la hematopoyesis aparentemente normal de los ancianos como en pacientes (pts) con cánceres mieloides. Durante mucho tiempo se anticipó que la metilación del ADN era una marca de silenciamiento permanente, pero con el descubrimiento de las diez enzimas de translocación once (TET) quedó claro que se produce una desmetilación activa. Los pasos iniciales de este proceso son catalizados por las enzimas TET, que, sin embargo, están frecuentemente mutadas y metiladas en los cánceres hematológicos. Las enzimas Jumonji, que catalizan la desmetilación de histonas, también se regulan de forma anómala en los cánceres hematológicos.

La vitamina C (VitC) se identificó en la década de 1930 como el micronutriente necesario en la prevención del escorbuto. A diferencia de las plantas y la mayoría de los animales, los humanos no pueden sintetizar vitC a partir de la glucosa debido a la falta de la enzima necesaria, la L-gulonolactona oxidasa. Por lo tanto, la vitC debe ser aportada a través de la dieta. Estudios recientes reconocen a la vitC como un cofactor importante para la familia de las dioxigenasas Fe(II) y 2-oxoglutarato. Estos incluyen las enzimas TET, que están involucradas en la conversión de 5-metilcitosina (5-mC) a sus derivados oxidados 5-hidroximetilcitosina (5-hmC), 5-carboxilcitosina (5-caC) y 5-formilcitosina (5-cm). -fC), y las enzimas Jumonji que están involucradas en la desmetilación de histonas. En consecuencia, vitC puede desempeñar potencialmente un papel importante en la regulación del ADN y la desmetilación de histonas. Sin embargo, se encontró que > 80 por ciento de los pacientes con cáncer hematológico presentaban una grave deficiencia de vitC. Curiosamente, los análisis de 20 participantes incluidos en el estudio piloto aleatorizado y controlado con placebo recientemente realizado por los investigadores (NCT02877277) muestran que el nivel de vitC en pacientes con SMD y LMMC que reciben tratamiento con azacitidina se eleva fácilmente al rango normal con suplementos orales de vitC (datos no publicados). Cuando los pacientes que ya estaban tomando suplementos de vitC se cambiaron a placebo, los niveles de vitC cayeron rápidamente por debajo del rango normal.

También se ha demostrado que la formación de 5-hmC y sus derivados puede estar comprometida en individuos sanos y pacientes con mutaciones TET. Sin embargo, dado que muchas de estas mutaciones son heterocigóticas y que las tres enzimas TET (TET1, TET2 y TET3) pueden tener cierta redundancia, la restauración de vitC a niveles fisiológicos podría tener un impacto en el nivel de 5-hmC/5-mC. en individuos con hematopoyesis clonal mutante TET o cáncer hematológico.

Los análisis de los niveles de 5-hmC/5-mC en células mononucleares (MNC) de sangre periférica (PB) de los participantes en el estudio piloto también mostraron una clara tendencia hacia un aumento de 5-hmC en el brazo de vitC; sin embargo, después de diseñar el ensayo, la Los investigadores se dieron cuenta de que los niveles de 5-hmC/5-mC se miden mejor en las células madre hematopoyéticas de la médula ósea (MO), donde los niveles son entre 10 y 20 veces más altos. Por lo tanto, el estudio piloto tendrá un seguimiento con un ensayo aleatorizado controlado con placebo de vitC oral en personas con tumores malignos mieloides de bajo riesgo; es decir, CCUS o MDS/CMML de bajo riesgo, para investigar si la vitC oral puede cambiar la biología de estas enfermedades y, en última instancia, prevenir la progresión.

Hipótesis:

1. Los investigadores y colaboradores han demostrado previamente que los pacientes con cáncer tienen deficiencia de vitC, y las personas con CCUS, que representa pre-MDS, también pueden tener deficiencia de vitC. La hipótesis es que esto puede conducir a niveles reducidos de 5-hmC/5-mC in vivo tanto en pacientes con cáncer como en individuos con CCUS.

2. Elevar los niveles séricos de vitC al rango normal en CCUS y pacientes con SMD/CMML de bajo riesgo mediante suplementos orales con vitC puede

   • reducir el clon maligno,
   • aumentar la relación 5-hmC/5-mC,
   • cambiar el perfil de citocinas plasmáticas hacia un perfil menos inflamatorio, menos tumorigénico,
   • cambiar la expresión génica

Objetivos:

Para determinar si la restauración de vitC al rango normal en CCUS y pacientes con MDS/CMML de bajo riesgo puede:

1. reducir el clon maligno,
2. aumentar la relación 5-hmC/5-mC en CCUS y pacientes con MDS/CMML de bajo riesgo
3. reducir la acumulación de 5-mC en promotores/potenciadores/repeticiones terminales largas (LTR), o en otras regiones genómicas reguladoras de supresores de tumores/genes impulsores metilados/genes involucrados en el desarrollo hematopoyético,
4. regular al alza la expresión de estos genes,
5. cambiar el perfil de citoquinas en plasma,
6. alterar la permeabilidad intestinal (medida por la concentración de ADN bacteriano en la sangre periférica) y/o la composición de la microbiota intestinal,
7. implicar ningún riesgo de seguridad.

PLAN DE INVESTIGACIÓN Se prevé incorporar un total de 100 pacientes. Se incluirán personas con CCUS, MDS de bajo riesgo o CMML-0 o -1 de Rigshospitalet, Herlev University Hospital, Odense University Hospital, Aalborg University Hospital o Keck Hospital of University of Southern California entre noviembre de 2017 y diciembre de 2021.

Los participantes entrarán en la aleatorización por bloques con una proporción de 1:1; vitC 1000 mg/día p.o. versus placebo durante un año.

Está prevista la inscripción de hasta 30 voluntarios ancianos sanos. Se determinará la cantidad y el tipo de ADN bacteriano en PB y servirán como controles.

MATERIAL Y MEDICIONES PB: Se tomarán muestras de PB (45 mL) al ingreso al estudio y cada 3 meses (o más si se requiere según elección del médico) durante el primer año.

Las mediciones incluyen hemogramas que incluyen recuento diferencial, niveles de ácido fólico, vitamina B12, vitamina D, hierro, ferritina, transferrina, saturación de transferrina, niveles plasmáticos de vitC, citoquinas y contenido de ADN bacteriano (referido al ADN bacteriano en la piel del paciente y en las heces) .

MO: Se tomarán muestras de MO (18 ml) al ingresar al estudio, después de 3 meses y después de un año.

Se medirán los niveles de vitC y varias citocinas. Las mutaciones en los genes implicados con frecuencia en el cáncer mieloide/hematopoyesis clonal, incluidos los reguladores epigenéticos y las frecuencias alélicas variantes (VAF) se investigarán mediante secuenciación dirigida de próxima generación en células BM CD34+ clasificadas (si están disponibles) o fracción negativa de BM de clasificación CD34+ al ingresar al estudio , después de 3 meses y después de un año.

La secuenciación de ARN y la evaluación de 5-hmC/5-mC totales se realizarán en células madre hematopoyéticas BM CD34+.

Heces: se recolectarán muestras de heces (9 ml) de un subconjunto de pacientes al ingresar al estudio, después de 3 meses y después de un año. El ADN bacteriano será extraído y secuenciado.

BIOBANCO DE INVESTIGACIÓN Se establecerá un biobanco de investigación en The Epi-/Genome Laboratory, Rigshospitalet / Biotech Research and Innovation Center para almacenar las muestras biológicas de los participantes. El biobanco de investigación está aprobado por el Comité Regional de Ética Científica y la Agencia Danesa de Protección de Datos de acuerdo con la Ley de Procesamiento de Datos Personales (licencia no. H-16022249 y 04864/RH-2016-259, respectivamente). Las MNC separadas crioconservadas de BM y PB se almacenarán además de los gránulos de granulocitos y el plasma. La fecha de cierre del biobanco de investigación es el 31-12-2030.

Para los estudios correlativos, las muestras biológicas se enviarán al Instituto de Investigación Van Andel, Grand Rapids, EE. UU., y al Imperial College, Londres, Reino Unido (colaboradores externos), para secuenciación de ARN y análisis de metilación e hidroximetilación de ADN, respectivamente. También se enviarán muestras biológicas a la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Copenhague y al Instituto Nacional de Veterinaria de la Universidad Técnica de Dinamarca (colaboradores externos) para medir las concentraciones séricas de vitC y analizar las respuestas de las células T, respectivamente.

MÉTODOS Medición de VitC: el ascorbato y el total de vitC, es decir, ascorbato + ácido dehidroascórbico (la forma oxidada de vitC; DHA), se cuantifican mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección culombimétrica; El DHA se evalúa restando el ascorbato del vitC total. El ácido úrico se utiliza como estándar interno endógeno.

Clasificación celular: Clasificación celular activada magnéticamente (MACS, utilizando un dispositivo EasySep).

Medición total de 5 hmC/5-mC: análisis de transferencia de puntos de 5 hmC. Medida de 5-hmC/5-mC por espectrometría de masas.

Medición específica de locus de 5 hmC/5 mC: "EPIC" 850 K BeadChips. Se medirán 5-hmC/5-mC en sitios seleccionados mediante pirosecuenciación.

Expresión génica: secuenciación de ARN total y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa.

Detección de mutaciones: secuenciación dirigida de próxima generación de un panel de genes recurrentemente mutados en el cáncer mieloide como se describe.

CONSIDERACIONES ESTADÍSTICAS Y CÁLCULO DE POTENCIA Este estudio es el primero en examinar los efectos de vitC como monoterapia en los niveles de 5-hmC/5-mC en células madre hematopoyéticas en humanos in vivo. Por lo tanto, no es posible realizar un cálculo de potencia o un cálculo de tamaño de muestra. El número de participantes (n=100) se establece como una estimación del número necesario para observar una posible diferencia significativa entre los grupos (vitC frente a placebo) en el criterio principal de valoración; cambio medio en VAF de mutaciones somáticas desde el inicio hasta los 12 meses.

Los análisis de eficacia son por intención de tratar. Los análisis de seguridad incluyen a todos los participantes que reciben al menos una dosis de la terapia del protocolo.

CONSIDERACIONES ÉTICAS El estudio ha sido aprobado por el Comité Regional de Ética Científica (H-16022249) y la Agencia Danesa de Protección de Datos (04864/RH-2016-259).

Todos los participantes incluidos en el proyecto serán informados oralmente y por escrito. Sólo se aceptará la participación previo consentimiento por escrito. Se informará a los participantes que pueden retirarse del estudio en cualquier momento y por cualquier motivo sin que ello afecte su tratamiento en el sistema de atención médica.

Con el enfoque de secuenciación de ADN dirigido descrito, existe un pequeño riesgo de detectar una mutación de la línea germinal en los participantes relacionada con la neoplasia maligna mieloide. Se pedirá a los participantes que indiquen en el consentimiento informado si no desean recibir más información relevante relacionada con la salud que pueda aparecer durante los análisis del proyecto. A menos que el participante indique explícitamente que no desea que se le informe sobre posibles hallazgos aleatorios relacionados con la salud en el estudio, se informará al participante y se le ofrecerán más investigaciones y asesoramiento genético en el hospital local en caso de hallazgos aleatorios.

Desventajas para el paciente, efectos secundarios, riesgos y complicaciones La extracción de sangre se asocia con molestias y/o dolor breves. No hay riesgos significativos asociados con el muestreo de sangre. Puede ocurrir sangrado local, que en casos raros puede causar molestias y decoloración durante unos días. En raras ocasiones, una muestra de sangre puede causar una reacción vasovagal que conduce a una breve pérdida del conocimiento.

La aspiración de MO se asocia con un breve dolor mientras se administra la anestesia local. Además, muchas personas experimentan una sensación incómoda en las piernas y las piernas mientras se aspira la evacuación intestinal. Esto dura aproximadamente 30 segundos. Finalmente, puede presentarse algo de sensibilidad durante unos días después del procedimiento. Las posibles complicaciones de someterse a una investigación de BM incluyen sangrado e infección. Sin embargo, la incidencia de estas complicaciones es extremadamente baja.

De acuerdo con las Recomendaciones Nórdicas de Nutrición, no hay evidencia de que la ingesta de vitC por encima de 1000 mg/día sea cancerígena o teratógena. Sin embargo, las ingestas altas (> 1000-2000 mg/día) pueden causar diarrea y otros trastornos gastrointestinales y las personas susceptibles pueden experimentar la formación de cálculos renales debido al aumento de la formación de oxalato. Dado que vitC solo se administra en dosis fisiológicas, se prevé que el estudio sea seguro y no suponga ningún riesgo adicional para los participantes; una suposición que está respaldada por la experiencia del estudio piloto.