Эпигенетика, витамин С и аномальное образование клеток крови - витамин С у пациентов с миелоидными новообразованиями низкого риска (EVITA)

ПРЕДПОСЫЛКИ Недавние исследования показали, что мутации в эпигенетических регуляторах являются обычным явлением как при нормальном гемопоэзе у пожилых людей, так и у пациентов (pts) с миелоидным раком. Давно предполагалось, что метилирование ДНК является постоянной меткой молчания, но с открытием десяти одиннадцати ферментов транслокации (TET) стало ясно, что происходит активное деметилирование. Начальные этапы этого процесса катализируются ферментами TET, которые, однако, часто мутируют и метилируются при гематологическом раке. Ферменты Jumonji, которые катализируют деметилирование гистонов, также аберрантно регулируются при гематологическом раке.

Витамин С (VitC) был определен в 1930-х годах как необходимый микроэлемент для профилактики цинги. В отличие от растений и большинства животных, люди не могут синтезировать витамин С из глюкозы из-за отсутствия необходимого фермента, L-гулонолактоноксидазы. Следовательно, vitC должен поступать с пищей. Недавние исследования признали vitC важным кофактором для семейства Fe(II)- и 2-оксоглутаратдиоксигеназы. К ним относятся ферменты ТЕТ, которые участвуют в превращении 5-метилцитозина (5-mC) в его окисленные производные 5-гидроксиметилцитозин (5-hmC), 5-карбоксицитозин (5-caC) и 5-формилцитозин (5-caC). -fC) и ферменты Jumonji, участвующие в деметилировании гистонов. Соответственно, vitC потенциально может играть важную роль в регуляции деметилирования ДНК и гистонов. Однако было обнаружено, что > 80% пациентов с гематологическим раком имеют серьезный дефицит vitC. Интересно, что анализ 20 участников, включенных в недавно проведенное исследователями рандомизированное плацебо-контролируемое пилотное исследование (NCT02877277), показывает, что уровень vitC у пациентов с МДС и CMML, получающих лечение азацитидином, легко повышается до нормального диапазона при пероральном приеме добавки vitC. (неопубликованные данные). Когда пациенты, которые уже принимали добавки vitC, были переведены на плацебо, уровни vitC быстро упали ниже нормального диапазона.

Также было показано, что образование 5-hmC и его производных может быть нарушено у здоровых людей и пациентов с мутациями TET. Однако, поскольку многие из этих мутаций являются гетерозиготными и поскольку три фермента TET (TET1, TET2 и TET3) могут иметь некоторую избыточность, восстановление vitC до физиологических уровней может повлиять на уровень 5-hmC/5-mC. у лиц с мутантным ТЕТ клональным кроветворением или гематологическим раком.

Анализы уровней 5-hmC/5-mC в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК) участников пилотного исследования также показали четкую тенденцию к увеличению 5-hmC в группе, получавшей витамин C, однако после разработки исследования исследователи поняли, что уровни 5-hmC/5-mC лучше измеряются в гемопоэтических стволовых клетках костного мозга (BM), где уровни в 10-20 раз выше. Таким образом, за пилотным исследованием последует рандомизированное плацебо-контролируемое исследование перорального приема витамина С у лиц с миелоидными злокачественными новообразованиями низкого риска; т. е. CCUS или МДС/ХММЛ с низким риском, чтобы выяснить, может ли пероральный прием vitC изменить биологию этих заболеваний и, в конечном итоге, предотвратить их прогрессирование.

Гипотезы:

1. Исследователи и сотрудники ранее показали, что пациенты с раком имеют дефицит vitC, и люди с CCUS, который представляет собой пре-MDS, также могут иметь дефицит vitC. Гипотеза состоит в том, что это может привести к снижению уровня 5-hmC/5-mC in vivo как у больных раком, так и у пациентов с CCUS.

2. Повышение уровня vitC в сыворотке до нормального диапазона у пациентов с CCUS и пациентов с МДС/ХММЛ низкого риска путем перорального приема vitC может

   • уменьшить злокачественный клон,
   • увеличить соотношение 5-hmC/5-mC,
   • изменить профиль цитокинов плазмы в сторону менее воспалительного, менее туморогенного профиля,
   • изменить экспрессию гена

Цели:

Чтобы определить, может ли восстановление vitC до нормального диапазона у пациентов с CCUS и пациентов с МДС/ХММЛ низкого риска:

1. уменьшить злокачественный клон,
2. увеличьте соотношение 5-hmC/5-mC при CCUS и пациентах с МДС/ХММЛ с низким риском
3. уменьшить накопление 5-mC в промоторах/энхансерах/длинных терминальных повторах (LTR) или в других регуляторных геномных областях опухолевых супрессоров/метилированных генов-драйверов/генов, участвующих в развитии кроветворения,
4. активировать экспрессию этих генов,
5. изменение цитокинового профиля плазмы,
6. изменять кишечную проницаемость (измеряемую по концентрации бактериальной ДНК в периферической крови) и/или состав кишечной микробиоты,
7. влекут за собой какие-либо риски безопасности.

ПЛАН ИССЛЕДОВАНИЯ Всего планируется включить 100 пациентов. В период с ноября 2017 г. по декабрь 2021 г. будут включены лица с CCUS, МДС низкого риска или CMML-0 или -1 из Rigshospitalet, Университетской больницы Херлева, Университетской больницы Оденсе, Университетской больницы Ольборга или больницы Кека Университета Южной Калифорнии.

Участники войдут в рандомизацию блоков с соотношением 1:1; витС 1000 мг/день перорально по сравнению с плацебо в течение одного года.

Планируется набор до 30 здоровых добровольцев пожилого возраста. Количество и тип бактериальной ДНК в PB будут определяться и служить в качестве контроля.

МАТЕРИАЛЫ И ИЗМЕРЕНИЯ ПБ: Образцы ПБ (45 мл) будут браться при включении в исследование и каждые 3 месяца (или чаще, если требуется по выбору врача) в течение первого года.

Измерения включают анализы крови, включая дифференциальный подсчет, уровни фолиевой кислоты, витамина B12, витамина D, железа, ферритина, трансферрина, насыщение трансферрина, уровни vitC в плазме, цитокины и содержание бактериальной ДНК (относится к бактериальной ДНК на коже пациента и в кале). .

БМ: Образцы БМ (18 мл) будут взяты при включении в исследование, через 3 месяца и через год.

Будут измерять уровни vitC и различных цитокинов. Мутации в генах, часто участвующих в миелоидном раке/клональном кроветворении, включая эпигенетические регуляторы и частоты вариантных аллелей (VAF), будут исследованы с помощью целевого секвенирования следующего поколения в отсортированных клетках BM CD34+ (если доступно) или BM-отрицательной фракции сортировки CD34+ на момент начала исследования. , через 3 месяца и через год.

Секвенирование РНК и общая оценка 5-hmC/5-mC будут выполняться на гемопоэтических стволовых клетках BM CD34+.

Фекалии: Образцы фекалий (9 мл) будут собираться у подгруппы пациентов при включении в исследование, через 3 месяца и через год. Бактериальная ДНК будет извлечена и секвенирована.

ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ БИОБАНК Будет создан исследовательский биобанк в Эпи-/геномной лаборатории Ригшоспиталет/Центра биотехнологических исследований и инноваций для хранения биологических образцов участников. Исследовательский биобанк одобрен Региональным комитетом по научной этике и Датским агентством по защите данных в соответствии с Законом об обработке персональных данных (лицензия №. H-16022249 и 04864/RH-2016-259 соответственно). Криоконсервированные МНК, отделенные от BM и PB, будут храниться в дополнение к осадкам гранулоцитов и плазме. Дата закрытия исследовательского биобанка 31-12-2030.

Для корреляционных исследований биологические образцы будут отправлены в Исследовательский институт Ван Андела, Гранд-Рапидс, США, и Имперский колледж, Лондон, Великобритания (внешние сотрудники), для секвенирования РНК и анализа метилирования и гидроксиметилирования ДНК соответственно. Биологические образцы также будут отправлены на факультет наук о жизни Копенгагенского университета и в Национальный ветеринарный институт Датского технического университета (внешние сотрудники) для измерения концентрации витамина С в сыворотке и анализа ответов Т-клеток соответственно.

МЕТОДЫ Измерение витК: аскорбат и общий витК, т. е. аскорбат + дегидроаскорбиновая кислота (окисленная форма витК; ДГК), количественно определяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с кулонометрическим детектированием; DHA оценивают путем вычитания аскорбата из общего vitC. Мочевая кислота используется в качестве эндогенного внутреннего стандарта.

Сортировка клеток: магнитно-активированная сортировка клеток (MACS, с использованием устройства EasySep).

Общее измерение 5-hmC/5-mC: дот-блот анализ 5-hmC. Измерение 5-hmC/5-mC методом масс-спектрометрии.

Специфическое для локуса измерение 5-hmC/5-mC: "EPIC" 850 K BeadChips. 5-hmC/5-mC в выбранных участках будут измеряться пиросеквенированием.

Экспрессия генов: секвенирование тотальной РНК и полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой.

Обнаружение мутаций: направленное секвенирование следующего поколения панели генов, периодически мутировавших при миелоидном раке, как описано.

СТАТИСТИЧЕСКИЕ СООБРАЖЕНИЯ И РАСЧЕТ МОЩНОСТИ Это исследование является первым исследованием, в котором изучалось влияние vitC в качестве монотерапии на уровни 5-hmC/5-mC в гемопоэтических стволовых клетках человека in vivo. Поэтому невозможно выполнить расчет мощности или расчет размера выборки. Количество участников (n = 100) установлено как оценка числа, необходимого для наблюдения потенциально значимой разницы между группами (vitC по сравнению с плацебо) в первичной конечной точке; медиана изменения VAF соматических мутаций от исходного уровня до 12 месяцев.

Анализ эффективности проводится по назначению лечения. Анализы безопасности включают всех участников, получивших хотя бы одну дозу протокольной терапии.

ЭТИЧЕСКИЕ СООБРАЖЕНИЯ Исследование было одобрено Региональным комитетом по научной этике (H-16022249) и Датским агентством по защите данных (04864/RH-2016-259).

Все участники, включенные в проект, будут проинформированы устно и письменно. Участие принимается только после письменного согласия. Участники будут проинформированы о том, что они могут в любое время по любой причине отказаться от участия в исследовании, что не повлияет на их лечение в системе здравоохранения.

Используя описанный подход к целевому секвенированию ДНК, существует небольшой риск обнаружения у участников мутации зародышевой линии, связанной с миелоидным злокачественным новообразованием. Участников попросят указать в информированном согласии, не хотят ли они получать какую-либо дополнительную информацию, связанную со здоровьем, которая может появиться в ходе анализа проекта. Если участник явно не заявляет, что он или она не хочет быть проинформированным о каких-либо потенциальных случайных результатах исследования, связанных со здоровьем, участник будет проинформирован и ему будут предложены дальнейшие исследования и генетическое консультирование в местной больнице в случае случайных результатов.

Недостатки пациентов, побочные эффекты, риски и осложнения Забор крови связан с кратковременным дискомфортом и/или болью. Никаких значительных рисков, связанных с забором крови. Может возникнуть местное кровотечение, которое в редких случаях может вызывать дискомфорт и изменение цвета в течение нескольких дней. В редких случаях забор крови может вызвать вазовагальную реакцию, приводящую к кратковременной потере сознания.

Аспирация БМ связана с кратковременной болью во время местной анестезии. Кроме того, многие люди испытывают неприятные ощущения в ягодицах и ногах во время аспирации БМ. Это длится примерно 30 секунд. Наконец, в течение нескольких дней после процедуры может возникать некоторая болезненность. Возможные осложнения проведения исследования БМ включают кровотечение и инфекцию. Однако частота этих осложнений крайне низка.

В соответствии со Скандинавскими рекомендациями по питанию нет доказательств того, что потребление витамина С выше 1000 мг/сутки является канцерогенным или тератогенным. Однако высокое потребление (> 1000-2000 мг/день) может вызвать диарею и другие желудочно-кишечные расстройства, а у восприимчивых людей может возникнуть образование камней в почках из-за повышенного образования оксалатов. Поскольку vitC вводят только в физиологических дозах, ожидается, что исследование будет безопасным и не создаст дополнительного риска для участников; предположение, которое подтверждается опытом экспериментального исследования.