癌特異的メチル化シグネチャを使用した結腸直腸癌および進行性腺腫の診断

1. 研究の背景

   1.1 結腸直腸癌の診断 結腸直腸癌は消化管によくみられる悪性腫瘍です。 2015 年の統計によると、中国の結腸直腸がんの罹患率と死亡率は、すべてのがんの上位 5 位に入っています。 研究によると、患者が腫瘍細胞の拡散前に診断された場合、患者の 5 年生存率は 90% を達成できることが示されています。 しかし、現在、初期段階で診断されている患者は 40% にすぎません。 そのため、大腸がんの治療には早期の治療が必要です。 診断のために臨床的に使用される主な方法は、大腸内視鏡検査です。 この方法は正確ですが、下痢、腸穿孔などの多くの要因によって制限され、検査前に多くの方法で準備する必要があります。 患者は流動食を食べたり、腸をきれいにしたりする必要があります。 画像診断や病理組織学的検査などの他の診断方法では、検出率が低く、臓器に損傷を与える可能性があります。 したがって、大腸がんを早期に発見することは依然として困難な課題です。

   1.2 結腸直腸癌患者における ctDNA メチル化の検出と臨床研究 エピジェネティクスとは、DNA の一次配列の変化を伴わない遺伝性の表現型の変化を指します。 DNA メチル化は、エピジェネティックな修飾経路の 1 つであり、クロマチン構造と DNA の安定性に変化をもたらし、遺伝子の転写と発現を調節します。 研究により、DNAメチル化が腫瘍の発生および発生と密接な関係があることがわかっています。 DNA メチル化の変化は、正常細胞と比較して、腫瘍細胞の DNA の多数の部位で発生します。 さらなる研究は、DNA メチル化ががんの初期段階で起こることを示しており、がんの早期スクリーニングに DNA メチル化を利用できるようになっています。

   Nature Genetics で Kun Zhang 教授によって発表された研究論文に基づいて、Singlera Genomics Inc. は独自のメチル-チタン配列決定技術を発明し、結腸直腸癌および進行性腺腫の検出方法 (腺腫/結腸直腸癌早期検出、ACE) を開発しました。 ACE は、血液ベースの非侵襲的診断技術です。 大腸内視鏡検査に比べて遵守率が高く、採便は便検査よりも簡便です。 また、既存の血液検査方法に比べてはるかに感度が高いです。 これらの利点から、ACE 技術は大腸がんの早期診断に適しています。

   開発段階で、Singlera Genomics Inc. は、ゲノム内の 400 万個の CpG メチル化部位に対してハイスループットで高カバレッジのスクリーニング方法を使用し、結腸直腸癌、腺腫、ポリープ組織サンプル、および対になった正常組織のさまざまな段階を分析して、結腸直腸癌をスクリーニングしました。 -関連メチル化部位。 がん患者と健康な人の血漿サンプルも分析され、結腸直腸がんの ctDNA メチル化マーカーが選択されました。

   現在の研究では、ACE 法を使用して血中の ctDNA を分析し、がん特異的な DNA メチル化マーカーを調べて、結腸直腸がんと腺腫の患者の鑑別診断を支援する予定です。 この技術は、疑わしい患者の診断における不快感を大幅に軽減し、結腸直腸癌のリスクの高い集団の診断を改善します。 より高い検出率は、結腸直腸癌の早期発見と早期治療に有益であり、医療費を効果的に節約し、患者の生存率を向上させます。

2. 研究目標

   2.1. 主な目標 結腸直腸癌および腺腫の補助診断のための血漿 ctDNA メチル化シーケンス技術に基づく検出システムを確立する。結腸直腸癌および腺腫に対する血漿 ctDNA メチル化シグネチャの診断的価値を評価すること。

   2.2. 二次目標 血漿 ctDNA メチル化シグナルと、大腸内視鏡検査の結果および手術標本の病理学的結果との関連性を評価すること。

3. 研究概要

   3.1 研究のデザインと計画 この研究は、前向き、オープン、対照、多施設共同研究でした。 登録されたサンプルには、陽性グループ (ステージ I ～ IV の結腸直腸がん、進行性腺腫を含む) と陰性グループ (非進行性腺腫、病理学的検査が陰性の患者、大腸内視鏡検査の結果が陰性の健康な人、良性過形成および異形成のない炎症性結腸直腸疾患を含む) が含まれます。 ）。 サンプルサイズは、陽性 700 件、陰性 600 件です。

   3.2 症例数とグループ化方式 本治験では 1,300 名の被験者を登録し、2 つのグループに分ける予定です。 陽性グループには、300 例の結腸直腸癌 (ステージ I-IV) と 400 例の進行性腺腫 (高悪性度異形成、絨毛腺腫、管状腺腫、鋸歯状病変など) が含まれます。 陰性グループ (合計 600 例) には、非進行性腺腫 (サイズが 10mm 以下、100 例以上)、炎症性結腸直腸疾患、良性過形成、病理組織学的検査で腫瘍のない患者、および正常な健康人が含まれます。

   3.3 調査手順

   3.3.1 患者のスクリーニング 研究者は、基本情報、病歴、家族歴、薬歴、および関連する臨床試験に参加したかどうかについて各被験者に質問し、選択基準を満たしているかどうかを判断します。 記録に基づいて、包含基準を満たす被験者は、最初に単純な陽性グループと陰性グループに分けられます。 インフォームドコンセントフォームは、登録された患者ごとに署名されます。

   最初のグループ分けを完了したすべての被験者は、大腸内視鏡検査および臨床管理を受ける前に末梢静脈血を採取します。 ctDNA 検出血漿分離要件に従って、20 ml の血液サンプルを遠心分離します。 上澄み血漿を回収し、直ちに冷蔵する。

   3.3.2 臨床検査 大腸内視鏡検査は、すべての被験者に対して行われます（外科的病理結果を有する被験者を除く）。 腸に病変のある患者には、大腸内視鏡検査を行って陽性か陰性かを判定します。 外科的切除が必要な陽性患者は、外科的組織病理学的結果に従ってさらに分類されます。 陰性の患者については、病変のタイプを明確にする必要があります。

   3.3.3 ACE テスト 特定のグループに割り当てられた被験者のすべての血漿サンプルは、Shanghai Singlera Genomics Inc. (No. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai) に輸送されます。 cfDNA は患者の血漿から抽出され、がん特異的な DNA メチル化プロファイルが分析されます。 血漿 ctDNA メチル化テストの結果に従って、登録された被験者の結腸直腸がんのリスクがスコアリングされ、グループ化情報と組み合わせて、早期がんおよび腺腫診断のための ctDNA のがん特異的メチル化プロファイルの臨床応用価値を評価します。

   3.4 エンドポイントの決定 陽性被験者は、外科的病理組織学的検査の結果に基づいて決定されます。陰性対象者は、大腸内視鏡検査の結果に基づいて決定されます。

   ctDNA メチル化プロファイルは、陽性および陰性被験者について分析されます。

4. 統計分析

4.1 サンプルサイズの推定 この研究の結果は、末梢血 ctDNA からの結腸直腸癌特異的メチル化シグナルです。 メチル化シグナルはすべて特定の重みで重ね合わされ、最終的なスコアは単一の数値形式になります。 予備的な結果では、対照群の平均値 (μ1) は 0.36、テスト群の平均値 (μ2) は 0.73 でした。 グループ間の平均差は δ = μ2 - μ1= 0.37 で、サンプル全体の標準偏差 s の標準偏差 σ は 0.42 です。 チェックレベルαを両側で0.005に設定します。 検証性能 β は 0.005 であり、t 値テーブルをクエリすると、t(α) = 2.807、t(β) = 2.576 が得られます。

サンプルサイズの計算には、次の式が使用されます。

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

計算結果はn=74.68、 これは 75 に丸められます。 登録されたサンプルには使用できないケースが 25% 含まれる可能性があることを考慮して、テスト グループの最小サンプル サイズは 100 ケースに設定されました。

陽性グループ 1、結腸直腸癌ステージ I ～ IV、各サブカテゴリにグループを割り当てる必要はありません。 他のグループとのサンプル数のバランスを考慮して、サンプル サイズは 300 ケースに設定されています。

陽性群 2、進行性腺腫 「大腸がんの診断と治療に関するガイドライン」によると、進行性腺腫は 4 つのカテゴリーに分類されます。 カテゴリごとに平均 100 ケース、合計 400 ケースで、異なるカテゴリに均等に分配する必要はありません。

否定的なグループは 3 つのカテゴリに分類されます。 非進行性腺腫は、陽性グループ 2 の陽性腺腫と区別する必要があり、100 例の最小サンプル サイズが必要です。 その他のカテゴリでは、特定のサンプル サイズは必要ありません。 他のグループとのバランスを考慮して、サンプルサイズは合計 600 ケースに設定されています。

4.2 統計とデータ分析 各サンプルのシーケンス データは、シーケンス データが事前に設定されたレベルに達しているかどうかなど、さまざまなパラメーターを使用してシーケンスの品質を評価されました。 Q30値が許容できるかどうか; CpG サイトのバランスが取れているかどうか、カバレッジが標準に達しているかどうか、アンプリコン シーケンスの深さが期待どおりかどうか、シーケンスの均一性が許容できるかどうか。

シーケンス結果の癌特異的 DNA メチル化シグナルは、以前の研究で確立されたモデルに従って要約および分析されます。 各信号値は、各サンプルのメチル化スコアを取得するために特定の重みで重ね合わされます。 各サンプルのグループ化情報と組み合わせて、PCA、クラスタリング、およびその他の分類分析が各サンプルに対して実行されます。 メチル化シグナルは、結腸直腸癌/腺腫のリスクスコアに変換されます。

陰性群と陽性群のリスクスコアの差に基づき、感度、特異度、陽性予測値を算出し、血漿ctDNAのがん特異的メチル化シグナルの臨床応用効果を評価します。