Diagnose av kolorektal kreft og avansert adenom ved bruk av kreftspesifikke metyleringssignaturer

1. Forskningsbakgrunn

   1.1 Diagnose av tykktarmskreft Kolorektal kreft er en vanlig malign svulst i fordøyelseskanalen. I følge statistikk fra 2015 er både sykelighet og dødelighet av tykktarmskreft i Kina blant de fem beste av alle krefttilfeller. Studier har vist at femårs overlevelsesraten for pasienter kan oppnå 90 % hvis pasienter blir diagnostisert før spredning av tumorceller. Imidlertid er bare 40 % av pasientene for øyeblikket diagnostisert på et tidlig stadium. Derfor er behandling i tidlig stadium av sykdommen et nødvendig middel for å takle tykktarmskreft. Den viktigste metoden som brukes klinisk for diagnose er koloskopi. Denne metoden er nøyaktig, men begrenset av mange faktorer, som diaré, tarmperforering, og må forberedes på mange måter før undersøkelsen. Pasientene må spise flytende kosthold, rense tarmen m.m. Andre diagnostiske metoder som bildediagnostikk, histopatologisk undersøkelse har lav deteksjonsrate, eller forårsaker skade på organet. Derfor er det en fortsatt utfordrende oppgave å oppdage tykktarmskreft på et tidlig stadium.

   1.2 Påvisning av ctDNA-metylering hos kolorektalkreftpasienter og kliniske studier Epigenetikk refererer til en arvelig fenotypisk endring uten endring i primærsekvensen til DNA. DNA-metylering er en av de epigenetiske modifikasjonsveiene, som kan forårsake endringer i kromatinstruktur og DNA-stabilitet, og regulere gentranskripsjon og ekspresjon. Studier har funnet at DNA-metylering har en nær sammenheng med forekomst og utvikling av svulster. DNA-metyleringsendringer forekommer på en rekke DNA-steder i tumorceller sammenlignet med normale celler. Ytterligere studier viser at DNA-metylering skjer tidlig i kreftprosessen, noe som gjør det mulig å bruke DNA-metylering for tidlig screening av kreft.

   Basert på forskningsoppgaven publisert av professor Kun Zhang i Nature Genetics, oppfant Singlera Genomics Inc. den proprietære metyl-Titan-sekvenseringsteknologien og utviklet en deteksjonsmetode for kolorektal kreft og avansert adenom (Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE). ACE er en blodbasert ikke-invasiv diagnostisk teknikk. Den har høy samsvarsgrad sammenlignet med koloskopi, og prøvetaking er mer praktisk enn avføringstesting. Den har også mye høyere følsomhet sammenlignet med eksisterende blodprøvemetoder. Basert på disse fordelene er ACE-teknologien egnet for tidlig diagnose av kolorektal kreft.

   Under utviklingsstadiet brukte Singlera Genomics Inc. en screeningsmetode med høy gjennomstrømning og høy dekning for 4 millioner CpG-metyleringssteder i genomet, og analyserte forskjellige stadier av tykktarmskreft, adenom, polyppvevsprøver og paret normalt vev for å screene kolorektal kreft -relaterte metyleringssteder. Plasmaprøver fra kreftpasienter og friske mennesker ble også analysert for å velge ctDNA-metyleringsmarkører for tykktarmskreft.

   Den nåværende studien planlegger å bruke ACE-metoden for å analysere ctDNA i blodet for de kreftspesifikke DNA-metyleringsmarkørene for å hjelpe til med differensialdiagnose av pasienter med kolorektal kreft og adenom. Denne teknikken vil i stor grad redusere ubehaget ved diagnostisering av mistenkte pasienter og forbedre diagnosen av høyrisikopopulasjoner av tykktarmskreft. Den høyere oppdagelsesraten er gunstig for tidlig oppdagelse og tidlig behandling av tykktarmskreft, noe som effektivt vil spare medisinske kostnader og forbedre pasientenes overlevelse.

2. Forskningsmål

   2.1. Primære mål Å etablere et deteksjonssystem basert på plasma-ctDNA-metyleringssekvenseringsteknologi for hjelpediagnose av kolorektal kreft og adenom; For å vurdere den diagnostiske verdien av plasma-ctDNA-metyleringssignatur for tykktarmskreft og adenom.

   2.2. Sekundære mål Å vurdere assosiasjonen mellom plasma-ctDNA-metyleringssignaler med koloskopiresultater og patologiske resultater av kirurgiske prøver.

3. Forskningsoversikt

   3.1 Forskningsdesign og planlegging Denne studien var en prospektiv, åpen, kontrollert, multisenterstudie. De registrerte prøvene inneholder en positiv gruppe (inkludert kolorektal kreft stadium I-IV, avansert adenom) og en negativ gruppe (ikke-avansert adenom, pasienter med negativ patologisk undersøkelse, friske personer med negative koloskopiresultater, godartet hyperplasi og inflammatorisk kolorektal sykdom uten dysplasi ). Prøvestørrelsene er: 700 tilfeller positive og 600 tilfeller negative.

   3.2 Antall saker og grupperingsopplegg Denne prøven planlegger å registrere 1300 forsøkspersoner, som deles inn i to grupper. Den positive gruppen inkluderer 300 tilfeller av tykktarmskreft (stadium I-IV) og 400 tilfeller av avansert adenom (dysplasi av høy grad, villøst adenom, tubulært adenom, taggete lesjoner, etc.). Den negative gruppen (totalt 600 tilfeller) inkluderer: ikke-avanserte adenomer (størrelse ≤10 mm, ikke mindre enn 100 tilfeller), inflammatorisk kolorektal sykdom, godartet hyperplasi, tumorfrie pasienter ved histopatologisk gjennomgang og normale friske mennesker.

   3.3 Forskningsprosedyre

   3.3.1 Pasientscreening Forskeren vil spørre hvert forsøksperson om grunnleggende informasjon, sykdomshistorie, familiehistorie, medisinhistorie, og hvorvidt de har deltatt relaterte kliniske studier for å avgjøre om de oppfyller inklusjonskriteriene. Basert på deres registreringer deles forsøkspersonene som oppfyller inklusjonskriteriene først i en enkel positiv gruppe og en negativ gruppe. Et informert samtykkeskjema vil bli signert for hver registrerte pasient.

   Alle forsøkspersoner som fullfører den innledende grupperingen vil få sitt perifere venøse blod samlet før de gjennomgår koloskopi og klinisk behandling. 20 ml av blodprøven sentrifugeres i henhold til kravene til ctDNA-deteksjonsplasmaseparasjon. Supernatantplasmaet samles opp og avkjøles umiddelbart.

   3.3.2 Klinisk undersøkelse Koloskopi utføres på alle emner (unntatt de som har kirurgiske patologiresultater). For pasienter med intestinale lesjoner utføres koloskopi for å avgjøre om de er positive eller negative. Positive pasienter som trenger kirurgisk reseksjon vil bli ytterligere klassifisert i henhold til deres kirurgiske histopatologiske resultater. For negative pasienter bør type lesjon avklares.

   3.3.3 ACE-testing Alle plasmaprøver av forsøkspersonene som er tildelt spesifikke grupper, blir transportert til Shanghai Singlera Genomics Inc. (nr. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). cfDNA ekstraheres fra pasientplasma, og kreftspesifikk DNA-metyleringsprofil analyseres. I henhold til resultatene av plasma-ctDNA-metyleringstest, blir risikoen for tykktarmskreft hos de registrerte forsøkspersonene skåret, og kombinert med grupperingsinformasjon for å vurdere den kliniske anvendelsesverdien av den kreftspesifikke metyleringsprofilen i ctDNA for tidlig kreft- og adenomdiagnose.

   3.4 Sluttpunktbestemmelse De positive forsøkspersonene bestemmes basert på resultatene av kirurgisk histopatologisk undersøkelse; de negative forsøkspersonene bestemmes basert på koloskopiresultater.

   CtDNA-metyleringsprofilen analyseres for positive og negative personer.

4. Statistisk analyse

4.1 Beregning av prøvestørrelse Resultatene av denne studien er kolorektal kreftspesifikke metyleringssignaler fra perifert blod ctDNA. Metyleringssignalene vil alle være overlagret med en viss vekt, og den endelige poengsummen er i en enkelt tallform. Våre foreløpige resultater viste at middelverdien for kontrollgruppen (μ1) var 0,36, og middelverdien for testgruppen (μ2) var 0,73. Den gjennomsnittlige forskjellen mellom gruppene var δ = μ2 - μ1= 0,37, standardavviket σ for det totale utvalgets standardavvik s er 0,42. Sett kontrollnivået α til 0,005 på begge sider. Verifikasjonsytelsen β er 0,005, og t-verditabellen spørres for å oppnå t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

Følgende formel brukes til å beregne prøvestørrelsen:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Det beregnede resultatet er n = 74,68, som er avrundet til 75. Tatt i betraktning at de registrerte prøvene kan ha 25 % ubrukelige tilfeller, ble den minste prøvestørrelsen på testgruppen satt til 100 tilfeller.

Positiv gruppe 1, tykktarmskreft stadium I-IV, ingen grunn til å tildele grupper i hver underkategori. Med tanke på å balansere antall utvalg mellom andre grupper, er utvalgsstørrelsen satt til 300 tilfeller.

Positiv gruppe 2, avansert adenom, ifølge «Retningslinjer for diagnose og behandling av tykktarmskreft», deles de avanserte adenomene inn i fire kategorier. Det er ikke behov for lik fordeling i ulike kategorier, med et gjennomsnitt på 100 saker per kategori, for totalt 400 saker.

Den negative gruppen er delt inn i tre kategorier. Ikke-avanserte adenomer må differensieres fra positive adenomer i positiv gruppe 2, og trenger en prøvestørrelse på minimum 100 tilfeller. Andre kategorier krever ikke en bestemt prøvestørrelse. Vurdert balansering med andre grupper er utvalgsstørrelsen satt til totalt 600 saker.

4.2 Statistikk og dataanalyse Sekvenseringsdata for hver prøve ble evaluert for sekvenseringskvalitet ved å bruke en rekke parametere, inkludert om sekvenseringsdataene når et forhåndsinnstilt nivå; om Q30-verdien er akseptabel; om CpG-stedet er balansert, om dekningen er opp til standard, om amplikonsekvenseringsdybden er som forventet, og om sekvenseringsuniformiteten er akseptabel.

De kreftspesifikke DNA-metyleringssignalene i sekvenseringsresultatene er oppsummert og analysert i henhold til modellen etablert i våre tidligere studier. Hver signalverdi legges over en viss vekt for å oppnå en metyleringsscore for hver prøve. Kombinert med grupperingsinformasjonen for hver prøve, utføres PCA, clustering og annen klassifiseringsanalyse for hver prøve. Metyleringssignalene konverteres deretter til en risikoscore for kolorektal kreft/adenom.

Basert på forskjellene i risikoscore mellom negativ gruppe og positiv gruppe, beregnes sensitiviteten, spesifisiteten og de positive predikerte verdiene, og den kliniske anvendelseseffektiviteten til det kreftspesifikke metyleringssignalet i plasma ctDNA blir evaluert.