Diagnostika kolorektálního karcinomu a pokročilého adenomu pomocí rakovinově specifických methylačních signatur

1. Pozadí výzkumu

   1.1 Diagnostika kolorektálního karcinomu Kolorektální karcinom je častý zhoubný nádor trávicího traktu. Podle statistiky z roku 2015 patří jak morbidita, tak mortalita na kolorektální karcinom v Číně mezi prvních pět všech rakovin. Studie ukázaly, že pětiletá míra přežití pacientů může dosáhnout 90 %, pokud jsou pacienti diagnostikováni před šířením nádorových buněk. Avšak pouze 40 % pacientů je v současnosti diagnostikováno v raném stádiu. Proto je léčba v časném stadiu onemocnění nezbytným prostředkem pro zvládnutí kolorektálního karcinomu. Hlavní metodou používanou klinicky pro diagnostiku je kolonoskopie. Tato metoda je přesná, ale omezená mnoha faktory, jako je průjem, perforace střeva, a je potřeba se na ni před vyšetřením v mnoha ohledech připravit. Pacienti potřebují jíst tekutou stravu, čistit střeva atd. Jiné diagnostické metody jako zobrazování, histopatologické vyšetření mají nízkou záchytnost nebo způsobují poškození orgánu. Odhalit kolorektální karcinom v časném stádiu je proto stále náročný úkol.

   1.2 Detekce metylace ctDNA u pacientů s kolorektálním karcinomem a klinické studie Epigenetika označuje dědičnou fenotypovou změnu bez změny primární sekvence DNA. Metylace DNA je jednou z epigenetických modifikačních drah, která může způsobit změny ve struktuře chromatinu a stabilitě DNA a regulovat transkripci a expresi genů. Studie zjistily, že metylace DNA má úzký vztah k výskytu a rozvoji nádorů. Změny methylace DNA se vyskytují na mnoha místech DNA v nádorových buňkách ve srovnání s normálními buňkami. Další studie ukazují, že k methylaci DNA dochází časně v procesu rakoviny, což umožňuje použít metylaci DNA pro včasné vyšetření rakoviny.

   Na základě výzkumné práce publikované profesorem Kun Zhangem v Nature Genetics společnost Singlera Genomics Inc. vynalezla patentovanou technologii sekvenování methyl-Titan a vyvinula metodu detekce kolorektálního karcinomu a pokročilého adenomu (Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE). ACE je neinvazivní diagnostická technika založená na krvi. Má vysokou míru poddajnosti ve srovnání s kolonoskopií a odběr vzorků je pohodlnější než testování stolice. Má také mnohem vyšší citlivost ve srovnání se stávajícími metodami testování krve. Na základě těchto výhod je technologie ACE vhodná pro časnou diagnostiku kolorektálního karcinomu.

   Během vývojové fáze Singlera Genomics Inc. použila vysoce výkonnou screeningovou metodu s vysokým pokrytím pro 4 miliony CpG metylačních míst v genomu a analyzovala různá stádia kolorektálního karcinomu, adenomu, vzorky tkáně polypů a spárovala normální tkáně pro screening kolorektálního karcinomu. související methylační místa. Vzorky plazmy od pacientů s rakovinou a zdravých lidí byly také analyzovány, aby se vybraly metylační markery ctDNA pro kolorektální karcinom.

   Současná studie plánuje použít metodu ACE k analýze ctDNA v krvi na methylační markery DNA specifické pro rakovinu, aby pomohla při diferenciální diagnostice pacientů s kolorektálním karcinomem a adenomem. Tato technika výrazně sníží nepohodlí při diagnostice podezřelých pacientů a zlepší diagnostiku vysoce rizikové populace kolorektálního karcinomu. Vyšší míra detekce je prospěšná pro včasnou detekci a včasnou léčbu kolorektálního karcinomu, což účinně ušetří náklady na léčbu a zlepší míru přežití pacientů.

2. Cíle výzkumu

   2.1. Primární cíle Vytvořit detekční systém založený na technologii sekvenování metylace ctDNA v plazmě pro pomocnou diagnostiku kolorektálního karcinomu a adenomu; Posoudit diagnostickou hodnotu signatury metylace ctDNA v plazmě pro kolorektální karcinom a adenom.

   2.2. Sekundární cíle Posoudit asociaci plazmatických metylačních signálů ctDNA s výsledky kolonoskopie a patologickými výsledky chirurgických vzorků.

3. Přehled výzkumu

   3.1 Návrh a plánování výzkumu Tato studie byla prospektivní, otevřená, kontrolovaná, multicentrická studie. Zapsané vzorky obsahují pozitivní skupinu (včetně kolorektálního karcinomu stadia I-IV, pokročilý adenom) a negativní skupinu (nepokročilý adenom, pacienti s negativním patologickým vyšetřením, zdraví lidé s negativními výsledky kolonoskopie, benigní hyperplazie a zánětlivé kolorektální onemocnění bez dysplazie ). Velikosti vzorků jsou: 700 pozitivních případů a 600 negativních případů.

   3.2 Počet případů a schéma seskupení Tato studie plánuje zapsat 1300 subjektů, které budou rozděleny do dvou skupin. Pozitivní skupina zahrnuje 300 případů kolorektálního karcinomu (stadium I-IV) a 400 případů pokročilého adenomu (high grade dysplazie, vilózní adenom, tubulární adenom, vroubkované léze atd.). Negativní skupina (celkem 600 případů) zahrnuje: nepokročilé adenomy (velikost ≤ 10 mm, ne méně než 100 případů), zánětlivé kolorektální onemocnění, benigní hyperplazii, pacienty bez tumoru po histopatologickém vyšetření a normální zdravé lidi.

   3.3 Postup výzkumu

   3.3.1 Screening pacientů Výzkumník se zeptá každého subjektu na základní informace, anamnézu onemocnění, rodinnou anamnézu, anamnézu medikace a zda se účastnil souvisejících klinických studií či nikoli, aby zjistil, zda splňují kritéria pro zařazení. Na základě svých záznamů jsou subjekty, které splňují kritéria pro zařazení, nejprve rozděleny do jednoduché pozitivní skupiny a negativní skupiny. Pro každého přihlášeného pacienta bude podepsán formulář informovaného souhlasu.

   Všem subjektům, které dokončí počáteční seskupení, bude odebrána periferní žilní krev před kolonoskopií a klinickou léčbou. 20 ml vzorku krve se odstředí podle požadavků na separaci plazmy detekční ctDNA. Supernatantová plazma se shromáždí a okamžitě zmrazí.

   3.3.2 Klinické vyšetření Kolonoskopie se provádí u všech subjektů (kromě těch, kteří mají výsledky chirurgické patologie). U pacientů se střevními lézemi se provádí kolonoskopie, aby se zjistilo, zda jsou pozitivní nebo negativní. Pozitivní pacienti, kteří potřebují chirurgickou resekci, budou dále klasifikováni podle jejich chirurgických histopatologických výsledků. U negativních pacientů by měl být objasněn typ léze.

   3.3.3 Testování ACE Všechny vzorky plazmy subjektů zařazených do specifických skupin jsou transportovány do Shanghai Singlera Genomics Inc. (č. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). cfDNA se extrahuje z plazmy pacienta a analyzuje se methylační profil DNA specifický pro rakovinu. Podle výsledků plazmatického metylačního testu ctDNA je riziko kolorektálního karcinomu u zařazených subjektů hodnoceno a kombinováno s informacemi o seskupování pro posouzení klinické aplikační hodnoty rakovinově specifického metylačního profilu v ctDNA pro časnou diagnostiku rakoviny a adenomu.

   3.4 Stanovení koncového bodu Pozitivní subjekty jsou určeny na základě výsledků chirurgického histopatologického vyšetření; negativní subjekty jsou určeny na základě výsledků kolonoskopie.

   Profil metylace ctDNA je analyzován pro pozitivní a negativní subjekty.

4. Statistická analýza

4.1 Odhad velikosti vzorku Výsledky této studie jsou metylační signály specifické pro kolorektální karcinom z ctDNA periferní krve. Všechny methylační signály budou superponovány s určitou váhou a konečné skóre je ve formě jediného čísla. Naše předběžné výsledky ukázaly, že průměrná hodnota kontrolní skupiny (μ1) byla 0,36 a průměrná hodnota testovací skupiny (μ2) byla 0,73. Průměrný rozdíl mezi skupinami byl δ = μ2 - μ1= 0,37, směrodatná odchylka σ celkové výběrové směrodatné odchylky s je 0,42. Nastavte kontrolní úroveň α na 0,005 na obou stranách. Ověřovací výkon β je 0,005 a tabulka hodnot t se dotazuje, aby se získalo t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

Pro výpočet velikosti vzorku se používá následující vzorec:

n = 2*((ta + tp)*S/5)2

Vypočtený výsledek je n = 74,68, což je zaokrouhleno na 75. Vzhledem k tomu, že zapsané vzorky mohou mít 25 % nepoužitelných případů, byla minimální velikost vzorku testovací skupiny stanovena na 100 případů.

Pozitivní skupina 1, kolorektální karcinom stadium I-IV, není třeba přidělovat skupiny do každé podkategorie. S ohledem na vyvážení počtu vzorků mezi ostatními skupinami je velikost vzorku nastavena na 300 případů.

Pozitivní skupina 2, pokročilý adenom, podle „Pokynů pro diagnostiku a léčbu kolorektálního karcinomu“ jsou pokročilé adenomy rozděleny do čtyř kategorií. Není potřeba rovnoměrné rozdělení v různých kategoriích, v průměru 100 případů na kategorii, celkem tedy 400 případů.

Negativní skupina je rozdělena do tří kategorií. Nepokročilé adenomy musí být odlišeny od pozitivních adenomů v pozitivní skupině 2 a potřebují minimální velikost vzorku 100 případů. Jiné kategorie nevyžadují konkrétní velikost vzorku. Vzhledem k bilancování s ostatními skupinami je velikost vzorku stanovena na celkem 600 případů.

4.2 Statistika a analýza dat U sekvenačních dat pro každý vzorek byla hodnocena kvalita sekvenování pomocí různých parametrů, včetně toho, zda data sekvenování dosahují předem nastavené úrovně; zda je hodnota Q30 přijatelná; zda je místo CpG vyvážené, zda pokrytí odpovídá standardu, zda hloubka sekvenování amplikonu odpovídá očekávání a zda je přijatelná uniformita sekvenování.

Signály methylace DNA specifické pro rakovinu ve výsledcích sekvenování jsou shrnuty a analyzovány podle modelu stanoveného v našich předchozích studiích. Každá hodnota signálu je superponována s určitou váhou, aby se získalo methylační skóre pro každý vzorek. V kombinaci s informacemi o seskupování každého vzorku se pro každý vzorek provádí analýza PCA, shlukování a další klasifikace. Methylační signály jsou pak převedeny na skóre rizika kolorektálního karcinomu/adenomu.

Na základě rozdílů rizikových skóre mezi negativní skupinou a pozitivní skupinou se vypočítá senzitivita, specificita a pozitivní predikované hodnoty a vyhodnotí se klinická aplikační účinnost rakovinově specifického metylačního signálu v plazmatické ctDNA.