Diagnostic du cancer colorectal et de l'adénome avancé à l'aide de signatures de méthylation spécifiques au cancer

1. Fond de recherche

   1.1 Diagnostic du cancer colorectal Le cancer colorectal est une tumeur maligne fréquente du tube digestif. Selon les statistiques de 2015, la morbidité et la mortalité du cancer colorectal en Chine figurent parmi les cinq premiers de tous les cancers. Des études ont montré que le taux de survie à cinq ans des patients peut atteindre 90% si les patients sont diagnostiqués avant la propagation des cellules tumorales. Cependant, seuls 40% des patients sont actuellement diagnostiqués à un stade précoce. Par conséquent, le traitement au stade précoce de la maladie est un moyen nécessaire pour faire face au cancer colorectal. La principale méthode utilisée cliniquement pour le diagnostic est la coloscopie. Cette méthode est précise, mais limitée par de nombreux facteurs, tels que la diarrhée, la perforation intestinale, et doit être préparée de plusieurs façons avant l'examen. Les patients doivent manger un régime liquide, nettoyer les intestins, etc. D'autres méthodes de diagnostic telles que l'imagerie, l'examen histopathologique ont un faible taux de détection ou causent des dommages à l'organe. Par conséquent, il reste difficile de détecter le cancer colorectal à un stade précoce.

   1.2 Détection de la méthylation de l'ADNct chez les patients atteints de cancer colorectal et les études cliniques L'épigénétique fait référence à un changement phénotypique héréditaire sans modification de la séquence primaire de l'ADN. La méthylation de l'ADN est l'une des voies de modification épigénétique, qui peut provoquer des changements dans la structure de la chromatine et la stabilité de l'ADN, et réguler la transcription et l'expression des gènes. Des études ont montré que la méthylation de l'ADN a une relation étroite avec l'apparition et le développement de tumeurs. Des changements de méthylation de l'ADN se produisent sur de nombreux sites d'ADN dans les cellules tumorales par rapport aux cellules normales. D'autres études montrent que la méthylation de l'ADN se produit tôt dans le processus du cancer, ce qui permet d'utiliser la méthylation de l'ADN pour le dépistage précoce du cancer.

   Sur la base du document de recherche publié par le professeur Kun Zhang dans Nature Genetics, Singlera Genomics Inc. a inventé la technologie exclusive de séquençage du méthyl-Titan et a développé une méthode de détection du cancer colorectal et de l'adénome avancé (Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE). L'ACE est une technique de diagnostic non invasive basée sur le sang. Il a un taux de conformité élevé par rapport à la coloscopie et l'échantillonnage est plus pratique que le test des selles. Il a également une sensibilité beaucoup plus élevée par rapport aux méthodes de test sanguin existantes. Sur la base de ces avantages, la technologie ACE convient au diagnostic précoce du cancer colorectal.

   Au cours de la phase de développement, Singlera Genomics Inc. a utilisé une méthode de dépistage à haut débit et à couverture élevée pour 4 millions de sites de méthylation CpG dans le génome et a analysé différents stades de cancer colorectal, d'adénome, d'échantillons de tissus polypes et de tissus normaux appariés pour dépister le cancer colorectal. sites de méthylation apparentés. Des échantillons de plasma de patients cancéreux et de personnes en bonne santé ont également été analysés pour sélectionner des marqueurs de méthylation de l'ADNct pour le cancer colorectal.

   L'étude actuelle prévoit d'utiliser la méthode ACE pour analyser l'ADNct dans le sang pour les marqueurs de méthylation de l'ADN spécifiques au cancer afin de faciliter le diagnostic différentiel des patients atteints de cancer colorectal et d'adénome. Cette technique permettra de réduire considérablement l'inconfort dans le diagnostic des patients suspects et d'améliorer le diagnostic de la population à haut risque de cancer colorectal. Le taux de détection plus élevé est bénéfique pour la détection précoce et le traitement précoce du cancer colorectal, ce qui réduira efficacement les coûts médicaux et améliorera le taux de survie des patients.

2. Objectifs de la recherche

   2.1. Objectifs principaux Établir un système de détection basé sur la technologie de séquençage plasmatique de la méthylation de l'ADNct pour le diagnostic auxiliaire du cancer colorectal et de l'adénome ; Évaluer la valeur diagnostique de la signature plasmatique de méthylation de l'ADNctc pour le cancer colorectal et l'adénome.

   2.2. Objectifs secondaires Évaluer l'association des signaux de méthylation de l'ADNct plasmatique avec les résultats de la coloscopie et les résultats pathologiques des échantillons chirurgicaux.

3. Aperçu de la recherche

   3.1 Conception et planification de la recherche Cette étude était une étude prospective, ouverte, contrôlée et multicentrique. Les échantillons inscrits contiennent un groupe positif (y compris cancer colorectal stade I-IV, adénome avancé) et un groupe négatif (adénome non avancé, patients avec examen pathologique négatif, personnes en bonne santé avec des résultats de coloscopie négatifs, hyperplasie bénigne et maladie colorectale inflammatoire sans dysplasie ). Les tailles d'échantillon sont : 700 cas positifs et 600 cas négatifs.

   3.2 Nombre de cas et schéma de regroupement Cet essai prévoit de recruter 1300 sujets, qui seront répartis en deux groupes. Le groupe positif comprend 300 cas de cancer colorectal (stade I-IV) et 400 cas d'adénome avancé (dysplasie de haut grade, adénome villeux, adénome tubulaire, lésions en dents de scie, etc.). Le groupe négatif (600 cas au total) comprend : les adénomes non avancés (taille ≤ 10 mm, pas moins de 100 cas), la maladie colorectale inflammatoire, l'hyperplasie bénigne, les patients sans tumeur après examen histopathologique et les personnes normales et en bonne santé.

   3.3 Procédure de recherche

   3.3.1 Dépistage des patients Le chercheur demandera à chaque sujet des informations de base, des antécédents de maladie, des antécédents familiaux, des antécédents de médication et s'il a participé ou non à des essais cliniques connexes pour déterminer s'il répond aux critères d'inclusion. Sur la base de leurs dossiers, les sujets répondant aux critères d'inclusion sont d'abord divisés en un groupe positif simple et un groupe négatif. Un formulaire de consentement éclairé sera signé pour chaque patient inscrit.

   Tous les sujets qui terminent le groupement initial verront leur sang veineux périphérique prélevé avant de subir une coloscopie et une prise en charge clinique. 20 ml de l'échantillon de sang sont centrifugés conformément aux exigences de séparation du plasma de détection d'ADNct. Le plasma surnageant est recueilli et immédiatement réfrigéré.

   3.3.2 Examen clinique La coloscopie est pratiquée sur tous les sujets (sauf ceux ayant des résultats de pathologie chirurgicale). Pour les patients présentant des lésions intestinales, une coloscopie est effectuée pour déterminer si elles sont positives ou négatives. Les patients positifs qui ont besoin d'une résection chirurgicale seront ensuite classés en fonction de leurs résultats histopathologiques chirurgicaux. Pour les patients négatifs, le type de lésion doit être précisé.

   3.3.3 Test ACE Tous les échantillons de plasma des sujets affectés à des groupes spécifiques sont transportés à Shanghai Singlera Genomics Inc. (n° 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). Le cfDNA est extrait du plasma du patient et le profil de méthylation de l'ADN spécifique au cancer est analysé. Selon les résultats du test de méthylation plasmatique de l'ADNct, le risque de cancer colorectal des sujets inscrits est noté et combiné avec des informations de regroupement pour évaluer la valeur d'application clinique du profil de méthylation spécifique au cancer dans l'ADNc pour le diagnostic précoce du cancer et de l'adénome.

   3.4 Détermination du point final Les sujets positifs sont déterminés sur la base des résultats de l'examen histopathologique chirurgical ; les sujets négatifs sont déterminés sur la base des résultats de la coloscopie.

   Le profil de méthylation du ctDNA est analysé pour les sujets positifs et négatifs.

4. analyses statistiques

4.1 Estimation de la taille de l'échantillon Les résultats de cette étude sont des signaux de méthylation spécifiques au cancer colorectal provenant de l'ADNc du sang périphérique. Les signaux de méthylation seront tous superposés avec un certain poids, et le score final est sous forme de nombre unique. Nos résultats préliminaires ont montré que la valeur moyenne du groupe témoin (μ1) était de 0,36 et la valeur moyenne du groupe test (μ2) était de 0,73. La différence moyenne entre les groupes était δ = μ2 - μ1 = 0,37, l'écart type σ de l'écart type global de l'échantillon s est de 0,42. Réglez le niveau de contrôle α sur 0,005 des deux côtés. La performance de vérification β est de 0,005 et la table de valeurs t est interrogée pour obtenir t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

La formule suivante est utilisée pour calculer la taille de l'échantillon :

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Le résultat calculé est n = 74,68, qui est arrondi à 75. Considérant que les échantillons inscrits peuvent avoir 25 % de cas inutilisables, la taille minimale de l'échantillon du groupe de test a été fixée à 100 cas.

Groupe positif 1, cancer colorectal stade I-IV, pas besoin d'attribuer des groupes dans chaque sous-catégorie. Compte tenu de l'équilibrage du nombre d'échantillons entre les autres groupes, la taille de l'échantillon est fixée à 300 cas.

Groupe positif 2, adénome avancé, selon les "Lignes directrices pour le diagnostic et le traitement du cancer colorectal", les adénomes avancés sont divisés en quatre catégories. Il n'y a pas besoin d'une répartition égale dans les différentes catégories, avec une moyenne de 100 cas par catégorie, pour un total de 400 cas.

Le groupe négatif est divisé en trois catégories. Les adénomes non avancés doivent être différenciés des adénomes positifs dans le groupe positif 2 et nécessitent un échantillon d'au moins 100 cas. Les autres catégories ne nécessitent pas de taille d'échantillon spécifique. Compte tenu de l'équilibrage avec d'autres groupes, la taille de l'échantillon est fixée à un total de 600 cas.

4.2 Statistiques et analyse des données La qualité du séquençage des données de chaque échantillon a été évaluée à l'aide de divers paramètres, notamment si les données de séquençage atteignent un niveau prédéfini ; si la valeur Q30 est acceptable ; si le site CpG est équilibré, si la couverture est conforme à la norme, si la profondeur de séquençage de l'amplicon est comme prévu et si l'uniformité du séquençage est acceptable.

Les signaux de méthylation de l'ADN spécifiques au cancer dans les résultats de séquençage sont résumés et analysés selon le modèle établi dans nos études précédentes. Chaque valeur de signal est superposée avec un certain poids pour obtenir un score de méthylation pour chaque échantillon. En combinaison avec les informations de regroupement de chaque échantillon, l'ACP, le regroupement et d'autres analyses de classification sont effectués pour chaque échantillon. Les signaux de méthylation sont ensuite convertis en un score de risque de cancer colorectal/adénome.

Sur la base des différences de scores de risque entre le groupe négatif et le groupe positif, la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédites positives sont calculées, et l'efficacité de l'application clinique du signal de méthylation spécifique au cancer dans l'ADNc plasmatique est évaluée.