Diagnóstico de cáncer colorrectal y adenoma avanzado utilizando firmas de metilación específicas del cáncer

1. Antecedentes de la investigación

   1.1 Diagnóstico del cáncer colorrectal El cáncer colorrectal es un tumor maligno común del tracto digestivo. Según las estadísticas de 2015, tanto la morbilidad como la mortalidad del cáncer colorrectal en China se encuentran entre los cinco principales de todos los cánceres. Los estudios han demostrado que la tasa de supervivencia de cinco años de los pacientes puede alcanzar el 90% si los pacientes son diagnosticados antes de que se propaguen las células tumorales. Sin embargo, solo el 40% de los pacientes se diagnostican actualmente en una etapa temprana. Por lo tanto, el tratamiento en la etapa temprana de la enfermedad es un medio necesario para hacer frente al cáncer colorrectal. El principal método utilizado clínicamente para el diagnóstico es la colonoscopia. Este método es preciso, pero está limitado por muchos factores, como diarrea, perforación intestinal y debe prepararse de muchas maneras antes del examen. Los pacientes necesitan comer una dieta líquida, limpiar los intestinos, etc. Otros métodos de diagnóstico, como la imagen, el examen histopatológico, tienen una tasa de detección baja o causan daño al órgano. Por lo tanto, aún es una tarea desafiante detectar el cáncer colorrectal en una etapa temprana.

   1.2 Detección de metilación de ctDNA en pacientes con cáncer colorrectal y estudios clínicos La epigenética se refiere a un cambio fenotípico heredable sin un cambio en la secuencia primaria del ADN. La metilación del ADN es una de las vías de modificación epigenética, que puede causar cambios en la estructura de la cromatina y la estabilidad del ADN, y regular la transcripción y expresión de genes. Los estudios han encontrado que la metilación del ADN tiene una estrecha relación con la aparición y el desarrollo de tumores. Los cambios de metilación del ADN ocurren en numerosos sitios de ADN en las células tumorales en comparación con las células normales. Otros estudios muestran que la metilación del ADN ocurre temprano en el proceso del cáncer, lo que hace posible usar la metilación del ADN para la detección temprana del cáncer.

   Con base en el artículo de investigación publicado por el profesor Kun Zhang en Nature Genetics, Singlera Genomics Inc. inventó la tecnología patentada de secuenciación de metil-titan y desarrolló un método de detección para el cáncer colorrectal y el adenoma avanzado (Detección temprana de adenoma/cáncer colorrectal, ACE). ACE es una técnica de diagnóstico no invasiva basada en sangre. Tiene una alta tasa de cumplimiento en comparación con la colonoscopia, y el muestreo es más conveniente que la prueba de heces. También tiene una sensibilidad mucho mayor en comparación con los métodos de análisis de sangre existentes. En base a estas ventajas, la tecnología ACE es adecuada para el diagnóstico temprano del cáncer colorrectal.

   Durante la etapa de desarrollo, Singlera Genomics Inc. utilizó un método de detección de alto rendimiento y alta cobertura para 4 millones de sitios de metilación de CpG en el genoma, y ​​analizó diferentes etapas de cáncer colorrectal, adenoma, muestras de tejido de pólipos y tejidos normales emparejados para detectar el cáncer colorrectal. sitios de metilación relacionados. También se analizaron muestras de plasma de pacientes con cáncer y personas sanas para seleccionar marcadores de metilación de ctDNA para el cáncer colorrectal.

   El estudio actual planea usar el método ACE para analizar el ctDNA en la sangre en busca de marcadores de metilación del ADN específicos del cáncer para ayudar en el diagnóstico diferencial de pacientes con cáncer colorrectal y adenoma. Esta técnica reducirá en gran medida la incomodidad en el diagnóstico de los pacientes sospechosos y mejorará el diagnóstico de la población de alto riesgo de cáncer colorrectal. La tasa de detección más alta es beneficiosa para la detección temprana y el tratamiento temprano del cáncer colorrectal, lo que ahorrará efectivamente costos médicos y mejorará la tasa de supervivencia de los pacientes.

2. Objetivos de la investigación

   2.1. Objetivos principales Establecer un sistema de detección basado en tecnología de secuenciación de metilación de ctDNA en plasma para el diagnóstico auxiliar de cáncer colorrectal y adenoma; Evaluar el valor diagnóstico de la firma de metilación del ctDNA en plasma para el cáncer colorrectal y el adenoma.

   2.2. Objetivos secundarios Evaluar la asociación de las señales de metilación del ctDNA en plasma con los resultados de la colonoscopia y los resultados patológicos de las muestras quirúrgicas.

3. Descripción general de la investigación

   3.1 Diseño y planificación de la investigación Este estudio fue prospectivo, abierto, controlado y multicéntrico. Las muestras enroladas contienen un grupo positivo (incluyendo cáncer colorrectal estadio I-IV, adenoma avanzado) y un grupo negativo (adenoma no avanzado, pacientes con examen patológico negativo, personas sanas con colonoscopia negativa, hiperplasia benigna y enfermedad colorrectal inflamatoria sin displasia ). Los tamaños de muestra son: 700 casos positivos y 600 casos negativos.

   3.2 Número de casos y esquema de agrupamiento Este ensayo tiene previsto inscribir 1300 sujetos, que serán asignados en dos grupos. El grupo positivo incluye 300 casos de cáncer colorrectal (estadio I-IV) y 400 casos de adenoma avanzado (displasia de alto grado, adenoma velloso, adenoma tubular, lesiones serradas, etc.). El grupo negativo (600 casos en total) incluye: adenomas no avanzados (tamaño ≤10 mm, no menos de 100 casos), enfermedad colorrectal inflamatoria, hiperplasia benigna, pacientes libres de tumor en revisión histopatológica y personas sanas normales.

   3.3 Procedimiento de investigación

   3.3.1 Selección de pacientes El investigador le preguntará a cada sujeto información básica, antecedentes de enfermedad, antecedentes familiares, historial de medicamentos y si ha participado o no en ensayos clínicos relacionados para determinar si cumple con los criterios de inclusión. Con base en sus registros, los sujetos que cumplen con los criterios de inclusión se dividen primero en un grupo positivo simple y un grupo negativo. Se firmará un formulario de consentimiento informado para cada paciente inscrito.

   A todos los sujetos que completen la agrupación inicial se les extraerá sangre venosa periférica antes de someterse a la colonoscopia y al tratamiento clínico. Se centrifugan 20 ml de la muestra de sangre de acuerdo con los requisitos de separación del plasma de detección de ctDNA. El plasma sobrenadante se recoge y se refrigera inmediatamente.

   3.3.2 Examen clínico La colonoscopia se realiza en todos los sujetos (excepto aquellos que tienen resultados de patología quirúrgica). Para pacientes con lesiones intestinales, se realiza una colonoscopia para determinar si son positivas o negativas. Los pacientes positivos que necesitan resección quirúrgica serán clasificados de acuerdo a sus resultados histopatológicos quirúrgicos. Para pacientes negativos, se debe aclarar el tipo de lesión.

   3.3.3 Pruebas ACE Todas las muestras de plasma de los sujetos asignados a grupos específicos se transportan a Shanghai Singlera Genomics Inc. (No. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). El cfDNA se extrae del plasma del paciente y se analiza el perfil de metilación del ADN específico del cáncer. De acuerdo con los resultados de la prueba de metilación de ctDNA en plasma, se califica el riesgo de cáncer colorrectal de los sujetos inscritos y se combina con información de agrupación para evaluar el valor de aplicación clínica del perfil de metilación específico del cáncer en ctDNA para el diagnóstico temprano de cáncer y adenoma.

   3.4 Determinación del punto final Los sujetos positivos se determinan en base a los resultados del examen histopatológico quirúrgico; los sujetos negativos se determinan en base a los resultados de la colonoscopia.

   El perfil de metilación de ctDNA se analiza para sujetos positivos y negativos.

4. análisis estadístico

4.1 Estimación del tamaño de la muestra Los resultados de este estudio son señales de metilación específicas del cáncer colorrectal de ctDNA de sangre periférica. Todas las señales de metilación se superpondrán con un cierto peso, y la puntuación final está en forma de un solo número. Nuestros resultados preliminares mostraron que el valor medio del grupo de control (μ1) fue de 0,36 y el valor medio del grupo de prueba (μ2) fue de 0,73. La diferencia de medias entre los grupos fue δ = μ2 - μ1= 0,37, la desviación estándar σ de la desviación estándar de la muestra global s es 0,42. Establezca el nivel de comprobación α en 0,005 en ambos lados. El rendimiento de verificación β es 0,005 y se consulta la tabla de valores t para obtener t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

La siguiente fórmula se utiliza para calcular el tamaño de la muestra:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

El resultado calculado es n = 74.68, que se redondea a 75. Teniendo en cuenta que las muestras inscritas pueden tener un 25 % de casos no utilizables, el tamaño mínimo de la muestra del grupo de prueba se fijó en 100 casos.

Grupo positivo 1, cáncer colorrectal estadio I-IV, no es necesario asignar grupos en cada subcategoría. Teniendo en cuenta equilibrar el número de muestras entre otros grupos, el tamaño de la muestra se establece en 300 casos.

Grupo 2 positivo, adenoma avanzado, según las “Pautas para el diagnóstico y tratamiento del cáncer colorrectal”, los adenomas avanzados se dividen en cuatro categorías. No hay necesidad de una distribución equitativa en diferentes categorías, con un promedio de 100 casos por categoría, para un total de 400 casos.

El grupo negativo se divide en tres categorías. Los adenomas no avanzados deben diferenciarse de los adenomas positivos en el grupo positivo 2 y necesitan un tamaño de muestra mínimo de 100 casos. Otras categorías no requieren un tamaño de muestra específico. Teniendo en cuenta el equilibrio con otros grupos, el tamaño de la muestra se establece en un total de 600 casos.

4.2 Estadísticas y análisis de datos Se evaluó la calidad de secuenciación de los datos de secuenciación de cada muestra utilizando una variedad de parámetros, incluido si los datos de secuenciación alcanzan un nivel preestablecido; si el valor Q30 es aceptable; si el sitio CpG está equilibrado, si la cobertura está a la altura del estándar, si la profundidad de secuenciación del amplicón es la esperada y si la uniformidad de la secuenciación es aceptable.

Las señales de metilación del ADN específicas del cáncer en los resultados de secuenciación se resumen y analizan de acuerdo con el modelo establecido en nuestros estudios anteriores. Cada valor de señal se superpone con un cierto peso para obtener una puntuación de metilación para cada muestra. En combinación con la información de agrupación de cada muestra, se realizan PCA, agrupación y otros análisis de clasificación para cada muestra. Las señales de metilación se convierten luego en una puntuación de riesgo de cáncer colorrectal/adenoma.

En función de las diferencias de las puntuaciones de riesgo entre el grupo negativo y el grupo positivo, se calculan la sensibilidad, la especificidad y los valores pronosticados positivos, y se evalúa la eficacia de la aplicación clínica de la señal de metilación específica del cáncer en el ADNc plasmático.