Diagnose van colorectale kanker en gevorderd adenoom met behulp van kankerspecifieke methyleringssignaturen

1. Onderzoeksachtergrond

   1.1 Diagnose van dikkedarmkanker Dikkedarmkanker is een veel voorkomende kwaadaardige tumor van het spijsverteringskanaal. Volgens statistieken uit 2015 behoren zowel de morbiditeit als de mortaliteit van colorectale kanker in China tot de top vijf van alle kankers. Studies hebben aangetoond dat de vijfjaarsoverleving van patiënten 90% kan bereiken als patiënten worden gediagnosticeerd vóór de verspreiding van tumorcellen. Echter, slechts 40% van de patiënten wordt momenteel in een vroeg stadium gediagnosticeerd. Daarom is behandeling in een vroeg stadium van de ziekte een noodzakelijk middel om colorectale kanker het hoofd te bieden. De belangrijkste methode die klinisch wordt gebruikt voor de diagnose is colonoscopie. Deze methode is nauwkeurig, maar wordt beperkt door vele factoren, zoals diarree, darmperforatie, en moet vóór het onderzoek op veel manieren worden voorbereid. De patiënten moeten een vloeibaar dieet volgen, de darmen reinigen, enz. Andere diagnostische methoden zoals beeldvorming, histopathologisch onderzoek hebben een lage detectiegraad of veroorzaken schade aan het orgaan. Daarom blijft het een uitdaging om dikkedarmkanker in een vroeg stadium op te sporen.

   1.2 Detectie van ctDNA-methylering bij colorectale kankerpatiënten en klinische studies Epigenetica verwijst naar een erfelijke fenotypische verandering zonder verandering in de primaire sequentie van het DNA. DNA-methylatie is een van de epigenetische modificatieroutes, die veranderingen in de chromatinestructuur en DNA-stabiliteit kan veroorzaken en gentranscriptie en -expressie kan reguleren. Studies hebben aangetoond dat DNA-methylatie een nauwe relatie heeft met het ontstaan ​​en de ontwikkeling van tumoren. DNA-methyleringsveranderingen vinden plaats op talrijke plaatsen van DNA in tumorcellen in vergelijking met normale cellen. Verdere studies tonen aan dat DNA-methylatie vroeg in het kankerproces plaatsvindt, waardoor het mogelijk wordt om DNA-methylatie te gebruiken voor vroege screening op kanker.

   Op basis van het onderzoeksartikel gepubliceerd door professor Kun Zhang in Nature Genetics, vond Singlera Genomics Inc. de gepatenteerde methyl-Titan sequencing-technologie uit en ontwikkelde een detectiemethode voor colorectale kanker en gevorderd adenoom (Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE). ACE is een op bloed gebaseerde niet-invasieve diagnostische techniek. Het heeft een hoog nalevingspercentage in vergelijking met colonoscopie, en bemonstering is handiger dan ontlastingstesten. Het heeft ook een veel hogere gevoeligheid in vergelijking met bestaande bloedtestmethoden. Op basis van deze voordelen is de ACE-technologie geschikt voor vroege diagnose van dikkedarmkanker.

   Tijdens de ontwikkelingsfase gebruikte Singlera Genomics Inc. een screeningmethode met hoge doorvoer en hoge dekking voor 4 miljoen CpG-methylatieplaatsen in het genoom, en analyseerde verschillende stadia van colorectale kanker, adenoom, poliepweefselmonsters en gepaarde normale weefsels om colorectale kanker te screenen -gerelateerde methyleringsplaatsen. Plasmamonsters van kankerpatiënten en gezonde mensen werden ook geanalyseerd om ctDNA-methylatiemarkers voor colorectale kanker te selecteren.

   De huidige studie is van plan om de ACE-methode te gebruiken om ctDNA in het bloed te analyseren op de kankerspecifieke DNA-methylatiemarkers om te helpen bij de differentiële diagnose van patiënten met colorectale kanker en adenoom. Deze techniek zal het ongemak bij de diagnose van verdachte patiënten aanzienlijk verminderen en de diagnose van een hoogrisicopopulatie van colorectale kanker verbeteren. Het hogere detectiepercentage is gunstig voor de vroege opsporing en vroege behandeling van colorectale kanker, wat effectief medische kosten zal besparen en de overlevingskans van patiënten zal verbeteren.

2. Onderzoeksdoelen

   2.1. Primaire doelstellingen Het opzetten van een detectiesysteem op basis van plasma-ctDNA-methylatie-sequencingtechnologie voor de hulpdiagnose van colorectale kanker en adenoom; Om de diagnostische waarde van plasma-ctDNA-methyleringssignatuur voor colorectale kanker en adenoom te beoordelen.

   2.2. Secundaire doelen Beoordelen van de associatie van plasma-ctDNA-methyleringssignalen met colonoscopieresultaten en pathologische resultaten van chirurgische monsters.

3. Onderzoek overzicht

   3.1 Onderzoeksopzet en planning Deze studie was een prospectieve, open, gecontroleerde, multicenter studie. De geregistreerde monsters bevatten een positieve groep (waaronder colorectale kanker stadium I-IV, gevorderd adenoom) en een negatieve groep (niet-gevorderd adenoom, patiënten met negatief pathologisch onderzoek, gezonde mensen met negatieve coloscopieresultaten, goedaardige hyperplasie en inflammatoire colorectale ziekte zonder dysplasie ). De steekproefomvang is: 700 gevallen positief en 600 gevallen negatief.

   3.2 Aantal casussen en groeperingsschema Voor deze proef zijn 1300 proefpersonen gepland, die in twee groepen zullen worden ingedeeld. De positieve groep omvat 300 gevallen van colorectale kanker (stadium I-IV) en 400 gevallen van gevorderd adenoom (hooggradige dysplasie, villi-adenoom, tubulair adenoom, gekartelde laesies, enz.). De negatieve groep (600 gevallen in totaal) omvat: niet-geavanceerde adenomen (grootte ≤ 10 mm, niet minder dan 100 gevallen), inflammatoire colorectale ziekte, goedaardige hyperplasie, tumorvrije patiënten bij histopathologisch onderzoek en normaal gezonde mensen.

   3.3 Onderzoeksprocedure

   3.3.1 Patiëntscreening De onderzoeker zal elke proefpersoon vragen om basisinformatie, ziektegeschiedenis, familiegeschiedenis, medicatiegeschiedenis en of ze al dan niet hebben deelgenomen aan gerelateerde klinische onderzoeken om te bepalen of ze voldoen aan de inclusiecriteria. Op basis van hun dossier worden de proefpersonen die aan de inclusiecriteria voldoen eerst verdeeld in een simpele positieve groep en een negatieve groep. Voor elke ingeschreven patiënt wordt een toestemmingsformulier ondertekend.

   Bij alle proefpersonen die de initiële groepering voltooien, wordt het perifere veneuze bloed afgenomen voordat ze colonoscopie en klinische behandeling ondergaan. 20 ml van het bloedmonster wordt gecentrifugeerd volgens de vereisten voor ctDNA-detectieplasmascheiding. Het bovenstaande plasma wordt verzameld en onmiddellijk gekoeld.

   3.3.2 Klinisch onderzoek Colonoscopie wordt uitgevoerd bij alle proefpersonen (behalve bij patiënten met chirurgische pathologische resultaten). Voor patiënten met darmlaesies wordt colonoscopie uitgevoerd om te bepalen of ze positief of negatief zijn. Positieve patiënten die chirurgische resectie nodig hebben, zullen verder worden geclassificeerd op basis van hun chirurgische histopathologische resultaten. Voor negatieve patiënten moet het type laesie worden opgehelderd.

   3.3.3 ACE-testen Alle plasmamonsters van de proefpersonen die aan specifieke groepen zijn toegewezen, worden getransporteerd naar Shanghai Singlera Genomics Inc. (nr. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). cfDNA wordt geëxtraheerd uit patiëntenplasma en het kankerspecifieke DNA-methylatieprofiel wordt geanalyseerd. Volgens de resultaten van de plasma-ctDNA-methylatietest wordt het risico op colorectale kanker van de ingeschreven proefpersonen gescoord en gecombineerd met groeperingsinformatie om de klinische toepassingswaarde van het kankerspecifieke methyleringsprofiel in ctDNA voor vroege diagnose van kanker en adenoom te beoordelen.

   3.4 Eindpuntbepaling De positieve proefpersonen worden bepaald op basis van de resultaten van chirurgisch histopathologisch onderzoek; de negatieve onderwerpen worden bepaald op basis van colonoscopieresultaten.

   Het ctDNA-methyleringsprofiel wordt geanalyseerd op positieve en negatieve proefpersonen.

4. statistische analyse

4.1 Schatting van de steekproefomvang De resultaten van deze studie zijn specifieke methyleringssignalen voor colorectale kanker van ctDNA uit perifeer bloed. De methyleringssignalen worden allemaal met een bepaald gewicht over elkaar heen gelegd en de uiteindelijke score is in de vorm van een enkel getal. Onze voorlopige resultaten toonden aan dat de gemiddelde waarde van de controlegroep (μ1) 0,36 was en de gemiddelde waarde van de testgroep (μ2) 0,73. Het gemiddelde verschil tussen de groepen was δ = μ2 - μ1= 0,37, de standaarddeviatie σ van de algehele steekproefstandaarddeviatie s is 0,42. Stel het controleniveau α in op 0,005 aan beide zijden. De verificatieprestatie β is 0,005 en de t-waardetabel wordt opgevraagd om t(α) = 2,807, t(β) = 2,576 te verkrijgen.

De volgende formule wordt gebruikt om de steekproefomvang te berekenen:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Het berekende resultaat is n = 74,68, dat wordt afgerond op 75. Aangezien de geregistreerde monsters 25% onbruikbare gevallen kunnen hebben, werd de minimale steekproefgrootte van de testgroep vastgesteld op 100 gevallen.

Positief groep 1, darmkanker stadium I-IV, het is niet nodig om groepen toe te wijzen in elke subcategorie. Als we het aantal steekproeven over andere groepen verdelen, wordt de steekproefomvang vastgesteld op 300 gevallen.

Positief groep 2, gevorderd adenoom, volgens de "Richtlijnen voor de diagnose en behandeling van dikkedarmkanker", zijn de gevorderde adenomen onderverdeeld in vier categorieën. Gelijke verdeling in verschillende categorieën is niet nodig, met gemiddeld 100 gevallen per categorie, op een totaal van 400 gevallen.

De negatieve groep is verdeeld in drie categorieën. Niet-geavanceerde adenomen moeten worden onderscheiden van positieve adenomen in positieve groep 2 en hebben een minimale steekproefomvang van 100 gevallen nodig. Andere categorieën vereisen geen specifieke steekproefomvang. Rekening houdend met het balanceren met andere groepen, is de steekproefomvang vastgesteld op in totaal 600 gevallen.

4.2 Statistieken en data-analyse Sequentiegegevens voor elk monster werden geëvalueerd op sequentiëringskwaliteit met behulp van een verscheidenheid aan parameters, waaronder of de sequentiëringsgegevens een vooraf ingesteld niveau bereiken; of de Q30-waarde acceptabel is; of de CpG-site in balans is, of de dekking aan de norm voldoet, of de amplicon-sequencing-diepte is zoals verwacht en of de sequencing-uniformiteit acceptabel is.

De kankerspecifieke DNA-methyleringssignalen in de sequentieresultaten worden samengevat en geanalyseerd volgens het model dat in onze eerdere studies is vastgesteld. Elke signaalwaarde wordt gesuperponeerd met een bepaald gewicht om een ​​methyleringsscore voor elk monster te verkrijgen. Gecombineerd met de groeperingsinformatie van elk monster, worden PCA, clustering en andere classificatieanalyses uitgevoerd voor elk monster. De methyleringssignalen worden vervolgens omgezet in een risicoscore voor colorectale kanker/adenoom.

Op basis van de verschillen in risicoscores tussen de negatieve groep en de positieve groep, worden de sensitiviteit, specificiteit en positief voorspelde waarden berekend en wordt de klinische toepassingsdoeltreffendheid van het kankerspecifieke methyleringssignaal in plasma-ctDNA geëvalueerd.